اندازه گیری افلاتوکسین ها توسط دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا HPLC

مقدمه:

آفلاتوکسین سم قارچ  است که از گونه‌ ای قارچ منشأ می‌گیرند. این قارچ‌ها معمولاً ذرت، بادام زمینی و پسته  را به راحتی آلوده می‌کنند و عموما گندم و برنج مقاوم‌تر هستند. آفلاتوکسین‌ها انسان را از راه مواد غذایی آلوده می‌کنند. در دهه 80 میلادی سازمان غذا و دارو امریکا نخستین بار میزان مایکوتوکسین مجاز در مواد غذایی را تعیین کرد. بیشتر از ۲۰ گونه آفلاتوکسین وجود دارد. اما چهار گونه اصلی آن شامل G1، B2، B1 و G2 هستند. آفلاتوکسین‌های M2 و M1 به ترتیب ناشی از هیدروکسیله شدن آفلاتوکسین‌های B2 و B1 هستند. آفلاتوکسین‌های M1 و M2 برای نخستین‌بار از شیر دام‌هایی که با خوراک آلوده تغذیه شده بودند جدا شدند. میزان سمیت آفلاتوکسین‌ها به ترتیب ذیل هستند: B1>G1>B2>G2.

پیشگیری:

اگر قارچ‌های مولد این سموم بر روی خوراک دام و مواد غذایی (مانند  بادام زمینی، ذرت و گندم) رشد کنند مصرف غذاهای آلوده به آفلاتوکسین می‌تواند موجب بیماری در انسان یا دام شود. هیچ موجود زنده‌ای از این سم در امان نیست. این سموم می‌توانند سیروز، نکروز یا سرطان معده و کبد ایجاد کند.

علائم بالینی اولیه مسمومیت کبدی ناشی از آفلاتوکسین شامل تب، درد عضله و بی‌اشتهایی است که بعد استفراغ،شکم درد و هپاتیت را به دنبال دارد. آفلاتوکسین با غلظت ۱۰ میکروگرم بر کیلوگرم اثر حاد مسمومیت کبدی دارد. با این حال مسمومیت حاد نادر و استثنایی است. مقادیر بسیار کمتر و به‌خصوص مصرف متداوم آفلاتوکسین نیز باعث از بین رفتن کبد می‌شود. ضایعات حاد کبد مانند تغییرات چربی، لرزش عضلانی، کما، تشنج و مرگ همراه با ادم مغز و درگیری اندامهایی نظیر کبد، کلیه و قلب هستند. آفلاتوکسین B1 از عوامل تراتوژنیک موتاژنیک و یکی از قویترین ترکیبات سرطان‌زا است.

افلاتوکسینها در لبنیات:

مشتق اصلی آفلاتوکسین در شیر به «آفلاتوکسین M1» شناخته می‌شود و گرچه از نوع B1 ضعیف‌تر است اما قدرت بیماری‌زایی آن دو همانند یکدیگر است. در روشهای صنعتی دامداری، بخش زیادی از خوراک دام از مواد غذایی فراوری شده مانند ذرت تامین می‌شود. آفلاتوکسین B1 پس از راه یافتن به دستگاه گوارش دام، از راه خوراک، جذب شده و در کبد حیوان به آفلاتوکسین M1 تبدیل شده و از راه خون به غدد پستانی و شیر وارد شود.

سم آفلاتوکسین مقاوم به گرما است و تحمل دمایی تا ۳۰۶ درجه سلسیوس دارد؛ بنابراین، پاستوریزاسیون شیر نمی‌تواند علیه سم آفلاتوکسین M1 مؤثر باشد. در سال ۲۰۱۲ گزارش کردند که نه پاستوریزاسیون و نه حتی جوشاندن شیر باعث کاهش سطح آفلاتوکسین M1 نمی‌شود.

در بسیاری از کشورهای جهان، بیشینه مجاز آلودگی آفلاتوکسین M1 را ۰/۰۵ میکروگرم در یک کیلو شیر است.

اندازه گیری آفلاتوکسین های گروه B و G با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

حد مجاز افلاتوکسینها در برخی مواد غذایی

دسـتگاه و تجهيـزات مـورد نيـاز جهت اندازه گیری آفلاتوکسینها

آفلاتوكســين ها از سموم بســيار خطرناك بوده و حلال هاي مورد استفاده در اين اســتاندارد ممكن است براي سلامت انسان خطر آفرين باشد. لذا بايد كار با آنها در زير هود يا فضاي آزمايشــگاهي كه به خوبي تهويه مي شــود و با دقت فراوان انجام شــود . به علت جذب پوستي سموم آفلاتوكسين، جهت محافظت از پوست دست و صورت، هنگام كار، از ماسك، دستكش پلاستيكي، عينك و روپوش آزمايشگاهي استفاده گردد.

انواع آفلاتوكسين ها به اشعه ماوراءبنفش حســاس مي باشــند. بنابراين اجراي تمام مراحل آزمايــش بايد حتــي الامكان در تاريكي در غياب نور مستقيم خورشيد و نور ســفيد مصنوعي بدون حفاظ جاذب uv صورت گيرد. پودر و يا فيلم خشك آفلاتوكسين ها بايد در درجه حرارت كمتر از صفر درجه سلسيوس نگهداري گردد.

تجهیزات مورد نیاز:

1-دستگاه HPLC ( دستگاه كروماتو گرافى با كارايــى بــالا) مجهز به دتکتور فلورسانس به همراه سیستم مشتق ساز پس ستون
2 -مخلوط كن آزمايشگاهي با دور بالا
explosion , speed High – Blender
Blender proof
3 -تكان دهنده عمودي
4 -كاغــذ صافي چيــن دار بــا قطر 24 سانتيمتر با قطر چشمههاي 30 ميكرومتر و يا كوچكتر
5 -ارلن ماير درپيچ دار يا سمباده اي 500 ميلي ليتري
6 -كاغذ صافي با الياف شيشه اي

7 -مخزن 75 ميلي ليتري با رابط قابل اتصال به ستون ايمينوافينيتي
8 -پمپ دستي با سرنگ 20 ميلي ليتري، سرچوب پنبه اي و يا لاستيكي براي اتصال به ستون ايمونوافينيتي و يا سيستم تحت خلا (منيفلد فشار منفي)
9 -بالــن ژوژه بــا حجم هــاي 2 ، 3 ، 10 و 20 ميلي ليتري (بايد داراي صحت حداقل 5/0 درصد باشند)
10 -پمپ كروماتوگرافي مايع مناسب براي سرعت جريان 005/0 – 000/1 ميلي ليتر در دقيقه
11 -سيســتم تزريق ، شــير با لوپ 200 ميكروليتر يا معادل آن
12 -ستون كرماتوگرافي مايع با فاز معكوس(μ m
4/mm6 × 25 Cm × 5 مثل 18 -LC يا 2-ODS(
13 -سيستم مشتق سازي پس ستون کبری سل
14 -سيستم مشتق سازي پس ستون با PBPB پمپ ثانويه بدون پالس، داراي قطعه T شكل با حجم مرده صفر، لوله واكنــش 45Cm با قطر داخلي 0mm/5 ازجنسPTFE
15 -سيســتم توليد برمين به روش الكتروشــيميايي Glasgow, Rhone Biopharm- R; Cell Kobra
16 -آشكارساز فلورسانس داراي فيلتر با طول موج تهييج 360 نانومتر و نشر 420 نانومتر يا معادل آن
17 -فيلتر يك بار مصرف از جنس سلولز يا نيترات سلولز(PTFE (با قطر چشمه هاي 45/0 ميكرومتر
18 -پيپت ژوژه 10 ميلي ليتري
19 -تــرازو با حساســيت 1/0 ميلي گــرم (0001/0 گرم)
20 -ترازو با حساسيت 1/0 گرم
21 -ســرنگ ميكروليتري يا پي پــت ميكروليتري كاليبره شده در حجم هاي 25 و 500 ميكروليتر
22 -ستون ايمونو افينيتي
Biopharm- R) & A.M , town Water (Vicam
UK, Glasgow, R

کاربرد ستون ایمونوافینیتی:

روش استفاده از ستون های ایمونوافینیتی تقریباً ساده است. ستون در ابتدا با محلول نمکی بافر فسفات (PBS) آماده (Condition) می شود و سپس عصاره نمونه حاوی آنالیت و درصد پایینی از حلال آلی به آرامی از روی ستون عبور داده می شود (Loading). پس از عبور عصاره از روی ستون، ژل توسط محلول نمکی بافر فسفات شست و شو داده شده (Washing) و در نهایت آنالیت های جذب شده بر روی ستون ایمونوافینیتی توسط یک حلال واجذبی – مانند متانول یا استونیتریل –  شکسته (Elution) و محلول واجذبی به دستگاه آنالیز مانند دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآئی بالا (HPLC)  تزریق و شناسائی و تعیین مقدار می گردد.