درباره دستگاه AKTA Pure

دستگاه AKTA Pure از شرکت Cytiva آمریکا یکی از پرکاربردترین سیستم‌های FPLC برای خالص‌سازی و جداسازی پروتئین‌ها در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و بیوتکنولوژی است. این دستگاه به دلیل ساختار مدولار، دقت بالای پمپ‌ها و کنترل نرم‌افزاری پیشرفته، امکان اجرای روش‌های مختلف کروماتوگرافی را فراهم می‌کند. یکی از کاربردهای مهم این سیستم، استفاده از آن در کروماتوگرافی اندازه‌محور (Size-Exclusion Chromatography یا SEC) است که بیشتر در مراحل نهایی خالص‌سازی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

روش کروماوگرافی Size-Exclusion Chromatography (SEC)

در روش SEC، جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اندازه و وزن مولکولی انجام می‌شود. ستون‌هایی مانند HiPrep Sephacryl S-200 HR که در این کاربرد به کار می‌روند، حاوی رزین‌هایی با حفره‌های کنترل‌شده هستند. مولکول‌های بزرگ‌تر به دلیل عدم ورود به این حفره‌ها، سریع‌تر از ستون عبور می‌کنند، در حالی که مولکول‌های کوچک‌تر زمان بیشتری در ستون باقی می‌مانند. به این ترتیب، پروتئین هدف از تجمع‌ها (Aggregates) و ناخالصی‌های کوچک‌تر به‌طور مؤثر جدا می‌شود.
دستگاه AKTA Pure در اجرای این روش، جریان یکنواخت و بدون نوسان را با استفاده از پمپ‌های دقیق فراهم می‌کند که برای حفظ قدرت تفکیک ستون بسیار حیاتی است. در روش SEC معمولاً از بافر ایزوکراتیک استفاده می‌شود و جداسازی بدون تغییر ناگهانی شرایط شیمیایی انجام می‌گیرد، به همین دلیل این روش بسیار ملایم و غیرتخریبی بوده و ساختار طبیعی پروتئین حفظ می‌شود.
پایش فرآیند جداسازی در AKTA Pure به کمک آشکارساز UV در طول موج 280 نانومتر انجام می‌شود و خروجی ستون به صورت فراکشن‌های مجزا جمع‌آوری می‌گردد. این فراکشن‌ها پس از بررسی، می‌توانند برای کاربردهای پایین‌دستی مانند مطالعات ساختاری، آزمون‌های عملکردی یا فرمولاسیون پروتئین مورد استفاده قرار گیرند. به طور کلی، استفاده از AKTA Pure در روش Size-Exclusion Chromatography راهکاری قابل اعتماد برای دستیابی به پروتئین با خلوص بالا، یکنواختی مناسب و کیفیت پایدار محسوب می‌شود.

اجزای تشکیل‌دهنده دستگاه AKTA Pure (روش SEC)

دستگاه AKTA Pure یک سیستم مدولار FPLC است که از چند بخش اصلی تشکیل شده و هر بخش نقش مشخصی در جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اندازه مولکولی ایفا می‌کند.

1. پمپ با دقت بالا
پمپ چهارتایی دستگاه وظیفه انتقال یکنواخت بافر را بر عهده دارد. در روش SEC، پایداری جریان اهمیت زیادی دارد زیرا هرگونه نوسان می‌تواند باعث کاهش قدرت تفکیک ستون شود. این پمپ امکان تنظیم دقیق دبی جریان را فراهم می‌کند.
2. مخازن بافر
بافر تعادل در مخازن مخصوص نگهداری می‌شود و به صورت ایزوکراتیک وارد سیستم می‌گردد. در روش SEC معمولاً از یک بافر ثابت استفاده می‌شود که شرایط پایدار جداسازی را حفظ می‌کند.
3. واحد تزریق نمونه
این بخش امکان ورود نمونه پروتئینی به سیستم را با حجم و سرعت کنترل‌شده فراهم می‌کند. در روش SEC، حجم نمونه اهمیت بالایی دارد و باید متناسب با حجم ستون انتخاب شود تا جداسازی بهینه انجام شود.
4. ستون کروماتوگرافی Size-Exclusion
ستون‌هایی مانند HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR قلب فرآیند SEC محسوب می‌شوند. این ستون‌ها حاوی رزین‌های متخلخل هستند که مولکول‌ها را بر اساس اندازه از یکدیگر جدا می‌کنند.
5. رزین Size-Exclusion
رزین‌های SEC دارای حفره‌هایی با اندازه کنترل‌شده هستند. مولکول‌های بزرگ‌تر سریع‌تر و مولکول‌های کوچک‌تر دیرتر از ستون خارج می‌شوند، بدون اینکه اتصال شیمیایی بین پروتئین و رزین ایجاد شود.
6. آشکارساز UV
آشکارساز UV معمولاً در طول موج 280 نانومتر قرار دارد و عبور پروتئین‌ها از ستون را به صورت لحظه‌ای پایش می‌کند. این بخش امکان مشاهده پیک‌های مربوط به پروتئین‌های مختلف را فراهم می‌سازد.
7. جمع‌کننده فراکشن
خروجی ستون به صورت فراکشن‌های جداگانه در لوله‌ها جمع‌آوری می‌شود. هر فراکشن می‌تواند حاوی یک جمعیت مشخص از مولکول‌ها باشد که بعداً بررسی می‌شوند.
8. سنسور فشار
این سنسور فشار سیستم را به طور مداوم پایش می‌کند تا از آسیب به ستون و رزین جلوگیری شود، به‌ویژه در ستون‌های بلند SEC که حساس‌تر هستند.
9. سنسور هدایت الکتریکی
هدایت الکتریکی بافر خروجی را اندازه‌گیری می‌کند تا ثبات شرایط بافر در طول جداسازی تضمین شود.
10. نرم‌افزار کنترلی UNICORN
نرم‌افزار UNICORN کنترل کامل دستگاه را بر عهده دارد؛ از تنظیم دبی جریان و ثبت داده‌های UV گرفته تا مدیریت جمع‌آوری فراکشن‌ها و تحلیل نتایج جداسازی.
جمع‌بندی
مجموعه این اجزا باعث می‌شود دستگاه AKTA Pure بتواند روش Size-Exclusion Chromatography را با دقت بالا، شرایط ملایم و تکرارپذیری مناسب اجرا کند و پروتئین‌هایی با خلوص و یکنواختی بالا در اختیار کاربر قرار دهد.

نحوه عملکرد دستگاه AKTA Pure در روش Size-Exclusion Chromatography (SEC)

دسگاه AKTA Pure در روش کروماتوگرافی اندازه‌محور (SEC) برای جداسازی و خالص‌سازی پروتئین‌ها بر اساس اندازه و وزن مولکولی استفاده می‌شود. این روش یکی از ملایم‌ترین و دقیق‌ترین تکنیک‌های خالص‌سازی است و معمولاً در مرحله نهایی (Polishing) به کار می‌رود تا پروتئین یکنواخت و بدون تجمع به دست آید.

1. آماده‌سازی سیستم و تعادل ستون
در ابتدای کار، ستون SEC با بافر تعادل ثابت (ایزوکراتیک) شسته می‌شود تا کل سیستم در شرایط پایدار قرار گیرد. در این روش، برخلاف روش‌های یونی، هیچ گرادیان نمک یا تغییر pH اعمال نمی‌شود. ثبات بافر برای حفظ قدرت تفکیک ستون و تکرارپذیری نتایج بسیار اهمیت دارد.
2. آماده‌سازی و تزریق نمونه

نمونه پروتئینی ابتدا سانتریفیوژ و فیلتر می‌شود تا ذرات معلق حذف شوند. سپس نمونه تا حجم مشخصی تغلیظ می‌گردد، زیرا در روش SEC حجم نمونه باید محدود و کنترل‌شده باشد. نمونه از طریق سیستم تزریق دستگاه وارد ستونت می‌شود، بدون اینکه با رزین واکنش شیمیایی برقرار کند.
3. عبور نمونه از ستون و جداسازی بر اساس اندازه
قلب عملکرد SEC در این مرحله اتفاق می‌افتد. ستون حاوی رزین‌های متخلخل با حفره‌های مشخص است:
مولکول‌های بزرگ‌تر قادر به ورود به حفره‌ها نیستند و مسیر کوتاه‌تری را طی می‌کنند، بنابراین زودتر از ستون خارج می‌شوند.
مولکول‌های کوچک‌تر وارد حفره‌ها شده و مسیر طولانی‌تری را طی می‌کنند، در نتیجه دیرتر از ستون خارج می‌شوند.
به این ترتیب، پروتئین‌های تجمع‌یافته، پروتئین‌های تک‌واحدی و ناخالصی‌های کوچک به‌صورت جداگانه از ستون خارج می‌شوند.
4. پایش فرآیند جداسازی
در طول خروج نمونه از ستون، آشکارساز UV در طول موج 280 نانومتر به‌صورت پیوسته جریان خروجی را بررسی می‌کند. هر پیک روی نمودار UV نشان‌دهنده عبور یک جمعیت مشخص از مولکول‌هاست. این پایش لحظه‌ای به اپراتور کمک می‌کند تا موقعیت دقیق پروتئین هدف را تشخیص دهد.
5. جمع‌آوری فراکشن‌ها
خروجی ستون وارد جمع‌کننده فراکشن می‌شود و محلول به حجم‌های مشخص (مثلاً 1 یا 2 میلی‌لیتر) تقسیم می‌گردد. فراکشن‌هایی که مربوط به پیک پروتئین هدف هستند، بر اساس داده‌های UV و آنالیزهای بعدی انتخاب و با هم ترکیب می‌شوند.
6. تحلیل و استفاده از پروتئین خالص‌شده
فراکشن‌های انتخاب‌شده معمولاً با روش‌هایی مانند SDS-PAGE یا تست‌های فعالیت زیستی بررسی می‌شوند. در صورت نیاز، پروتئین خالص‌شده می‌تواند دیالیز یا تغلیظ شود تا برای مراحل بعدی مانند مطالعات ساختاری، آزمون‌های عملکردی یا فرمولاسیون آماده گردد.
7. شستشو و آماده‌سازی دستگاه برای استفاده بعدی
پس از پایان کار، ستون و مسیرهای دستگاه با بافر مناسب شسته می‌شوند تا از باقی‌ماندن نمونه جلوگیری شود. سپس ستون طبق دستورالعمل سازنده نگهداری می‌شود تا کیفیت آن در دفعات بعدی حفظ گردد.
جمع‌بندی عملکرد
در روش SEC، دستگاه AKTA Pure بدون ایجاد تغییرات شیمیایی یا اتصال پروتئین به رزین، جداسازی را صرفاً بر پایه اندازه مولکولی انجام می‌دهد. این ویژگی باعث می‌شود ساختار طبیعی پروتئین حفظ شده و محصول نهایی دارای خلوص، یکنواختی و پایداری بالا باشد

نکات کلیدی در عملکرد AKTA Pure (روش SEC)

حجم نمونه محدود باشد: برای حفظ قدرت تفکیک ستون، حجم نمونه نباید بیشتر از ۱ تا ۵ درصد حجم ستون باشد.
ثبات جریان اهمیت دارد: جریان یکنواخت و بدون نوسان باعث جداسازی دقیق‌تر و پیک‌های واضح‌تر می‌شود.
بدون گرادیان کار می‌کند: در روش SEC تنها از یک بافر ثابت استفاده می‌شود و تغییر ناگهانی شرایط شیمیایی وجود ندارد.
آماده‌سازی نمونه ضروری است: سانتریفیوژ و فیلتراسیون نمونه از گرفتگی ستون و افت کیفیت جداسازی جلوگیری می‌کند.
دما کنترل شود: انجام فرایند در دمای مناسب (معمولاً 4–8°C) به حفظ پایداری پروتئین کمک می‌کند.
پایش UV مداوم باشد: بررسی سیگنال UV در 280 نانومتر برای تشخیص دقیق محل خروج پروتئین هدف ضروری است.
پیک‌ها تفسیر شوند: پیک‌های زودهنگام معمولاً مربوط به تجمع‌ها و پیک‌های دیرتر مربوط به ناخالصی‌های کوچک هستند.
جمع‌آوری دقیق فراکشن‌ها: انتخاب صحیح بازه فراکشن‌ها روی خلوص نهایی تأثیر مستقیم دارد.
فشار سیستم کنترل شود: افزایش فشار می‌تواند نشانه گرفتگی ستون یا سرعت جریان نامناسب باشد.
ستون به‌درستی نگهداری شود: شستشو و ذخیره‌سازی صحیح ستون باعث افزایش طول عمر و تکرارپذیری نتایج می‌شود.

آموزش کار با دستگاه AKTA Pure (روش Size-Exclusion Chromatography)

۱. آماده‌سازی قبل از شروع
قبل از راه‌اندازی دستگاه، اطمینان حاصل کنید که تمامی اجزا به‌درستی نصب شده‌اند و سیستم عاری از هوا و آلودگی است.
بافر تعادل (مثلاً 20 mM Tris-HCl، 150 mM NaCl، pH 7.4) را آماده و دی‌گاز کنید
مسیرهای بافر و پمپ‌ها را هواگیری کنید
ستون SEC را طبق جهت فلش روی ستون نصب کنید
فشار مجاز ستون را بررسی کنید
۲. آماده‌سازی نمونه پروتئینی
کیفیت نمونه تأثیر مستقیم بر نتیجه SEC دارد.
نمونه را در 4°C سانتریفیوژ کنید (حدود 15,000 × g، 30 دقیقه)
از فیلتر 0.22 µm عبور دهید
در صورت نیاز نمونه را تغلیظ کنید
حجم نمونه را به حداکثر 1–5٪ حجم ستون محدود کنید
۳. تعادل ستون (Equilibration)
ستون را با حداقل 2 حجم ستون (CV) بافر تعادل شستشو دهید
دبی جریان را مطابق مشخصات ستون تنظیم کنید (مثلاً 1 mL/min)
از پایدار شدن سیگنال UV و فشار اطمینان حاصل کنید
۴. تزریق نمونه
نمونه را از طریق پورت تزریق یا لوپ نمونه وارد دستگاه کنید
تزریق را با دبی کمتر (0.5–1 mL/min) انجام دهید
پس از ورود کامل نمونه، جریان را به مقدار عملیاتی بازگردانید
۵. جداسازی و پایش فرایند
جداسازی با همان بافر تعادل ادامه می‌یابد (ایزوکراتیک)
آشکارساز UV در طول موج 280 نانومتر را فعال نگه دارید
پیک‌های مربوط به تجمع‌ها، پروتئین تک‌واحدی و ناخالصی‌ها را مشاهده کنید
۶. جمع‌آوری فراکشن‌ها
جمع‌کننده فراکشن را روی حجم مناسب (1–2 mL) تنظیم کنید
فراکشن‌ها را بر اساس پیک UV جمع‌آوری کنید
لوله‌های حاوی پروتئین هدف را علامت‌گذاری کنید
۷. بررسی و ترکیب فراکشن‌ها
فراکشن‌ها را با SDS-PAGE یا تست فعالیت بررسی کنید
فراکشن‌های مناسب را با هم Pool کنید
در صورت نیاز، نمونه نهایی را دیالیز یا تغلیظ کنید
۸. شستشو و پایان کار
ستون را با بافر مناسب شستشو دهید
مسیرهای دستگاه را تمیز کنید
داده‌ها و کروماتوگرام‌ها را در نرم‌افزار UNICORN ذخیره کنید
ستون را طبق دستورالعمل سازنده نگهداری نمایید

نکات مهم ایمنی و عملیاتی

بافره%A