درباره دستگاه مدل AKTA Pure

دستگاه ÄKTA pure یکی از سیستم‌های پیشرفته خالص‌سازی پروتئین در حوزه بیوتکنولوژی و صنایع زیستی است که برای اجرای روش‌های مختلف کروماتوگرافی در مقیاس تحقیقاتی تا پایلوت طراحی شده است. این سیستم با کنترل دقیق دبی، فشار، گرادیان نمک و پایش هم‌زمان جذب نوری در طول موج 280 نانومتر، امکان جداسازی هدفمند و تکرارپذیر پروتئین‌ها را فراهم می‌کند. در پروژه‌های تولید پروتئین نوترکیب یا فرآیندهای توسعه بیوفارما، استفاده از این پلتفرم به دلیل دقت بالا و قابلیت برنامه‌ریزی کامل مراحل خالص‌سازی، بسیار رایج است.
در روش Cation Exchange Chromatography (CEX) در مقیاس پایلوت، تمرکز بر جداسازی پروتئین‌هایی است که در pH مشخص دارای بار مثبت هستند. در این شرایط، پروتئین هدف به رزین تبادل یونی قوی مانند SP Sepharose متصل می‌شود، در حالی‌که بسیاری از ناخالصی‌ها بدون اتصال از ستون عبور می‌کنند. پس از مرحله شستشو، با افزایش تدریجی غلظت نمک، قدرت یونی محیط بالا رفته و پروتئین بر اساس شدت اتصال خود از رزین جدا می‌شود. این فرآیند امکان دستیابی به خلوص بالا و بازیابی مناسب در حجم‌های بیشتر را فراهم می‌سازد.
کاربرد این روش در مقیاس پایلوت، به‌ویژه زمانی اهمیت دارد که نیاز به افزایش ظرفیت تولید، حذف مؤثر آلاینده‌های باردار و آماده‌سازی پروتئین برای مراحل بعدی فرآیند وجود داشته باشد. تنظیم دقیق pH، کنترل گرادیان نمک و پایش آنلاین کروماتوگرام، باعث می‌شود فرآیند خالص‌سازی با حداقل اتلاف نمونه و بیشترین بازده انجام شود. به همین دلیل، ترکیب سیستم AKTA Pure با روش Cation Exchange به‌عنوان یک راهکار قابل اعتماد در خطوط توسعه و تولید پروتئین شناخته می‌شود.

اجزای تشکیل دهنده دستگاه AKTA Pure در روش Cation Exchange Pilot Scale

در روش  Cation Exchange Chromatography (Pilot-Scale) که برای خالص‌سازی پروتئین‌های با بار مثبت استفاده می‌شود، دستگاه شامل چند بخش اصلی است که هر کدام نقش مهمی در جداسازی دقیق و کنترل‌شده دارند:

1. سیستم پمپ (Quaternary Pump)
پمپ چهارتایی قلب دستگاه محسوب می‌شود. این بخش امکان ترکیب دقیق چند بافر مختلف و ایجاد گرادیان نمکی کنترل‌شده (مثلاً 0 تا 1 مولار NaCl) را فراهم می‌کند. در این روش ایجاد گرادیان برای جدا کردن پروتئین‌های متصل‌شده به رزین تبادل کاتیونی ضروری است.

2. سیستم تزریق نمونه (Injection System / Sample Loop)
نمونه پروتئینی که قبلاً سانتریفیوژ و فیلتر شده است، از طریق این بخش وارد سیستم می‌شود. حجم تزریق و سرعت ورود نمونه باید کنترل شود تا از اشباع شدن ستون جلوگیری شود.

3. ستون کروماتوگرافی (SP Sepharose HP 5 mL)
مهم‌ترین بخش جداسازی همین ستون است. داخل ستون رزین Strong Cation Exchange قرار دارد که دارای گروه‌های سولفونات با بار منفی است. این گروه‌ها به پروتئین‌های با بار مثبت در pH 6 متصل می‌شوند و امکان جداسازی بر اساس بار الکتریکی را فراهم می‌کنند.

4. آشکارساز UV (در طول موج 280 نانومتر)
این دتکتور برای پایش جذب پروتئین‌ها در حین خروج از ستون استفاده می‌شود. چون اکثر پروتئین‌ها به دلیل وجود اسیدهای آمینه آروماتیک در 280 نانومتر جذب دارند، این بخش به ما کمک می‌کند پیک‌های مربوط به پروتئین هدف را شناسایی کنیم.

5.سیستم جمع‌آوری فراکشن (Fraction Collector)
پس از آشکارسازی، محلول خروجی به صورت فراکشن‌های مشخص (مثلاً 1 میلی‌لیتری) جمع‌آوری می‌شود. سپس بر اساس شدت جذب UV، فراکشن‌های حاوی پروتئین هدف با هم ترکیب (Pool) می‌شوند.

6. سیستم کنترل و نرم‌افزار (UNICORN Software)
این نرم‌افزار تمام مراحل شامل تنظیم دبی، گرادیان، ثبت کروماتوگرام و کنترل جمع‌آوری فراکشن‌ها را مدیریت می‌کند و امکان آنالیز دقیق داده‌ها را فراهم می‌سازد.
اگر بخواهی، می‌توانم همین توضیح را در قالب رسمی‌تر و مناسب گزارش کار آزمایشگاهی یا مقاله هم برایت تنظیم کنم.

نحوه عملکرد دستگاه AKTA Pure در روش Cation Exchange Pilot Scale

در روش FPLC با کروماتوگرافی تبادل کاتیونی (Cation Exchange – Pilot Scale)، عملکرد دستگاه بر اساس جداسازی مولکول‌ها بر پایه بار مثبت آن‌ها انجام می‌شود. روند کار به‌صورت مرحله‌ای به شکل زیر است:
1. آماده‌سازی سیستم
ابتدا دستگاه AKTA Pure روشن شده و مسیرهای جریان با آب دیونیزه و سپس با بافر تعادلی (20 mM Sodium Phosphate, pH=6.0) شستشو داده می‌شوند تا هوا از سیستم خارج شود و شرایط pH و هدایت یکنواخت گردد. ستون SP Sepharose HP نیز با چند حجم ستونی (CV) از بافر تعادلی اکویلیبره می‌شود.
2. بارگذاری نمونه
نمونه پروتئینی که قبلاً سانتریفیوژ و فیلتر 0.22 میکرون شده و pH آن تنظیم شده است، توسط پمپ چهارتایی با دبی مشخص (حدود 1–2 mL/min) وارد ستون می‌شود. در این pH، پروتئین هدف بار مثبت دارد و به گروه‌های سولفونات با بار منفی روی رزین متصل می‌شود، در حالی که ناخالصی‌های فاقد بار مناسب عبور می‌کنند.
3.شستشو (Wash)
پس از اتمام بارگذاری، ستون با بافر تعادلی شسته می‌شود تا مواد غیرمتصل و اتصال‌های ضعیف حذف شوند. این مرحله باعث افزایش خلوص اولیه می‌شود.
4. مرحله الیوژن (Elution)
دستگاه با استفاده از سیستم گرادیان، غلظت نمک (NaCl) را از 0 تا 1 مولار به‌صورت خطی افزایش می‌دهد. یون‌های سدیم با پروتئین‌های متصل رقابت کرده و آن‌ها را بر اساس شدت اتصال از رزین جدا می‌کنند. پروتئین‌هایی که اتصال ضعیف‌تری دارند زودتر و آن‌هایی که بار قوی‌تری دارند در غلظت نمک بالاتر خارج می‌شوند.
5. پایش و جمع‌آوری فراکشن‌ها
خروجی ستون توسط دتکتور UV در طول موج 280 نانومتر مانیتور می‌شود و پیک‌های پروتئینی روی کروماتوگرام ثبت می‌گردد. فراکشن کالکتور به‌صورت خودکار نمونه‌ها را در حجم‌های مشخص (مثلاً 1 mL) جمع‌آوری می‌کند.
6. تجمیع و پایان کار
فراکشن‌های حاوی پیک اصلی شناسایی و با یکدیگر Pool می‌شوند. در پایان، ستون با بافر شستشو یا ذخیره تمیز شده و سیستم برای استفاده بعدی آماده می‌شود.
در مجموع، عملکرد دستگاه در این روش مبتنی بر کنترل دقیق دبی، گرادیان نمک، پایش آنلاین جذب UV و جمع‌آوری هدفمند فراکشن‌هاست تا پروتئین کاتیونی با خلوص بالا در مقیاس پایلوت به دست آید.

نکات کلیدی عملکرد

در روش Cation Exchange Pilot-Scale با دستگاه AKTA Pure رعایت چند نکته کلیدی باعث افزایش بازده خالص‌سازی و جلوگیری از افت کیفیت پروتئین می‌شود:
1.کنترل دقیق pH
مهم‌ترین عامل در تبادل کاتیونی، تنظیم صحیح pH است. pH باید پایین‌تر از نقطه ایزوالکتریک (pI) پروتئین هدف باشد تا پروتئین بار مثبت داشته باشد و بتواند به رزین متصل شود. حتی تغییرات جزئی در pH می‌تواند باعث کاهش اتصال یا افت خلوص شود.
2. هدایت الکتریکی (Conductivity) نمونه
غلظت نمک در نمونه قبل از تزریق باید پایین باشد. وجود نمک بالا باعث رقابت با پروتئین برای اتصال به رزین شده و ظرفیت اتصال را کاهش می‌دهد. در صورت نیاز، نمونه باید دیالیز یا دسالته شود.
3. کنترل دبی جریان (Flow Rate)
دبی بالا زمان تماس را کم می‌کند و ممکن است اتصال کامل انجام نشود. در مقیاس پایلوت معمولاً 1–2 mL/min مناسب است، اما بسته به حجم ستون و نوع پروتئین باید بهینه‌سازی شود.
4. طراحی صحیح گرادیان نمک
شیب گرادیان NaCl باید متناسب با قدرت اتصال پروتئین انتخاب شود. گرادیان ملایم (مثلاً 0–1 M طی 20 CV) تفکیک بهتری ایجاد می‌کند، در حالی که گرادیان تند‌تر سرعت کار را بالا می‌برد اما ممکن است رزولوشن کاهش یابد.
5. پایش دقیق UV در 280 nm
بررسی شکل پیک‌ها اهمیت زیادی دارد. پیک‌های پهن یا نامتقارن می‌توانند نشانه اضافه‌بارگذاری ستون یا مشکلات جریان باشند. ثبت صحیح کروماتوگرام برای تحلیل خلوص ضروری است.
6. جلوگیری از اضافه‌بارگذاری ستون
هر ستون ظرفیت مشخصی دارد. بارگذاری بیش از حد باعث کاهش رزولوشن و عبور پروتئین هدف بدون اتصال کامل می‌شود. ظرفیت دینامیکی رزین باید قبل از شروع کار مشخص باشد.
7. شستشو و نگهداری ستون
پس از پایان فرآیند، ستون باید با بافر حاوی نمک بالا یا محلول شستشوی مناسب تمیز شود تا پروتئین‌های باقیمانده حذف شوند. نگهداری صحیح باعث افزایش طول عمر رزین می‌شود.
8.فیلتراسیون نمونه
وجود ذرات معلق باعث افزایش فشار سیستم و آسیب به رزین می‌شود. استفاده از فیلتر 0.22 میکرون قبل از تزریق الزامی است.
اگر این نکات به‌درستی رعایت شوند، عملکرد دستگاه در روش تبادل کاتیونی پایلوت‌اسکیل بسیار پایدار، تکرارپذیر و با خلوص بالا خواهد بود.

آموزش کار با  دستگاه AKTA Pure در روش Cation Exchange Pilot Scale

مرحله 1: آماده‌سازی اولیه سیستم
دستگاه را روشن کنید و نرم‌افزار کنترل (UNICORN) را اجرا کنید.
از پر بودن مخازن بافر A (بافر تعادلی) و بافر B (بافر حاوی 1M NaCl) مطمئن شوید.
خطوط ورودی بافر را هواگیری (Prime) کنید تا هیچ حبابی در سیستم باقی نماند.
دتکتور UV را روی 280 nm تنظیم کنید.
در این روش معمولاً:
Buffer A: 20 mM Sodium Phosphate, pH 6.0
Buffer B: همان بافر + 1 M NaCl
مرحله 2: آماده‌سازی ستون
ستون SP Sepharose HP را به سیستم متصل کنید.
فشار سیستم را چک کنید (نباید از حد مجاز ستون بیشتر شود).
ستون را با 5 CV از بافر تعادلی شستشو دهید تا کاملاً Equilibrate شود.
بررسی کنید خط پایه UV پایدار شده باشد.
pH بافر باید کمتر از pI پروتئین هدف باشد تا پروتئین بار مثبت داشته باشد.
مرحله 3: آماده‌سازی نمونه
نمونه پروتئینی را 30 دقیقه در 4°C با 15000×g سانتریفیوژ کنید.
محلول را از فیلتر 0.22 µm عبور دهید.
pH نمونه را روی 6.0 تنظیم کنید.
در صورت بالا بودن نمک، نمونه را دیالیز یا دسالته کنید.
مرحله 4: بارگذاری نمونه (Sample Loading)
ولو ورودی را روی موقعیت Sample قرار دهید.
دبی جریان را روی 1–2 mL/min تنظیم کنید.
نمونه را تزریق کنید.
جذب UV را مانیتور کنید. اگر پیک در این مرحله ظاهر شود، نشان‌دهنده عدم اتصال کامل است.
مرحله 5: شستشو (Wash)
پس از اتمام بارگذاری، سیستم را به Buffer A برگردانید.
حدود 5 CV شستشو انجام دهید.
تا زمانی که خط پایه UV پایدار شود ادامه دهید.
مرحله 6: الوشن (Elution)
برنامه گرادیان خطی 0 تا 100% Buffer B را طی 20 CV تنظیم کنید.
گرادیان نمک باعث جدا شدن پروتئین‌های متصل بر اساس قدرت اتصال می‌شود.
UV 280 nm را پایش کنید.
فراکشن کالکتور را روی 1 mL تنظیم کنید.
پروتئین هدف معمولاً در غلظت مشخصی از نمک (مثلاً 200–500 mM) جدا می‌شود.
مرحله 7: جمع‌آوری و آنالیز
فراکشن‌های حاوی پیک اصلی را جمع‌آوری کنید.
با SDS-PAGE بررسی خلوص انجام دهید.
فراکشن‌های مناسب را Pool کنید.
مرحله 8: شستشو و نگهداری ستون
ستون را با 1M NaCl شستشو دهید تا پروتئین‌های باقی‌مانده جدا شوند.
در صورت نیاز با محلول شستشوی توصیه‌شده CIP تمیز کنید.
ستون را در محلول نگهدارنده مناسب ذخیره کنید.
نکات حرفه‌ای هنگام کار
هرگز اجازه ندهید ستون خشک شود.
از وارد شدن هوا به سیستم جلوگیری کنید.
فشار سیستم را دائماً مانیتور کنید.
ظرفیت دینامیکی ستون را در نظر بگیرید و بیش از حد بارگذاری نکنید.
دمای پایین (4°C) باعث حفظ پایداری پروتئین می‌شود.

نکات ایمنی وعملیاتی

1. ایمنی شیمیایی
هنگام کار با بافرهای حاوی نمک غلیظ (1M NaCl) یا تنظیم pH با اسید و باز، حتماً از دستکش و عینک آزمایشگاهی استفاده کنید.
در صورت استفاده از محلول‌های شستشوی قوی (CIP)، تماس مستقیم پوستی را کاملاً کنترل کنید.
محلول‌ها را در ظروف برچسب‌دار و دربسته نگهداری کنید.
2. ایمنی بیولوژیک
در صورتی که نمونه از منبع سلولی یا باکتریایی است، آن را بالقوه آلوده در نظر بگیرید.
پساب خروجی دستگاه را طبق دستورالعمل ایمنی آزمایشگاه دفع کنید.
از تماس مستقیم با لیزات خام خودداری کنید.
3.ایمنی فشاری سیستم
دستگاه AKTA Pure با فشار بالا کار می‌کند؛ هرگز در زمان فعال بودن پمپ، اتصالات را باز نکنید.
حداکثر فشار مجاز ستون SP Sepharose HP را بررسی کنید و از آن تجاوز نکنید.
افزایش ناگهانی فشار معمولاً نشان‌دهنده گرفتگی فیلتر یا ستون است.

 نکات مهم عملیاتی

1. هواگیری کامل سیستم
وجود حباب هوا باعث:
نوسان در سیگنال UV
کاهش راندمان جداسازی
آسیب به رزین ستون
قبل از شروع کار حتماً خطوط را Prime کنید.
2. تطابق pH با pI پروتئین
در روش تبادل کاتیونی:
pH باید پایین‌تر از نقطه ایزوالکتریک (pI) پروتئین باشد
در غیر این صورت پروتئین به رزین متصل نخواهد شد
3. جلوگیری از Overloading
بارگذاری بیش از ظرفیت ستون باعث:
پهن شدن پیک
کاهش خلوص
افت راندمان جداسازی
همیشه ظرفیت بایندینگ رزین را در نظر بگیرید.
4. کنترل دما
دمای بالا باعث دناتوره شدن پروتئین می‌شود.
در صورت امکان از کولد روم (4°C) استفاده کنید.
5.پایش مداوم فشار و UV
فشار پایدار نشان‌دهنده عملکرد صحیح سیستم است.
تغییرات غیرعادی در سیگنال UV می‌تواند نشانه مشکل در نمونه یا ستون باشد.
6. شستشو و نگهداری صحیح ستون
بعد از پایان کار، ستون را با نمک بالا شستشو دهید.
هرگز ستون را خشک نکنید.
در محلول نگهدارنده توصیه‌شده ذخیره کنید.

⚠️ خطاهای رایج که باید از آن‌ها جلوگیری شود
تنظیم نکردن pH نمونه
فیلتراسیون نکردن نمونه
شروع گرادیان بدون پایدار شدن خط پایه
باز کردن اتصالات تحت فشار