درباره دستگاه AKTA Pure روش کروماتوگرافی Affinity (His-tag)

دستگاه AKTA Pure یکی از پرکاربردترین سیستم‌های خالص‌سازی پروتئین به روش FPLC است. این دستگاه برای انجام کروماتوگرافی افینیتی، به‌ویژه در خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب دارای His-tag استفاده می‌شود. این دستگاه با بهره‌گیری از ستون‌های اختصاصی مانند HisTrap HP امکان جداسازی هدفمند پروتئین موردنظر را از مخلوط‌های پیچیده‌ای مثل لیزات سلولی فراهم می‌کند. طراحی دقیق سیستم پمپاژ، کنترل پایدار دبی و نظارت پیوسته بر جذب نوری در طول فرآیند، باعث می‌شود خالص‌سازی با دقت بالا و نتایج قابل تکرار انجام شود.
در این روش، پروتئین دارای برچسب هیستیدینی به‌طور اختصاصی به یون نیکل متصل به رزین ستون متصل شده و سایر اجزای ناخواسته طی مرحله شستشو حذف می‌شوند. سپس با افزایش تدریجی غلظت ایمیدازول در بافر واجذب، پروتئین هدف از ستون جدا شده و در فراکشن‌های مجزا جمع‌آوری می‌شود. دستگاه AKTA Pure با امکان برنامه‌ریزی دقیق مراحل کاری و ثبت داده‌ها، گزینه‌ای مناسب برای آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و واحدهای تولیدی است که به خالص‌سازی سریع، کنترل‌شده و با کیفیت بالای پروتئین نیاز دارند.

روش کروماتوگرافیAffinity

روش کروماتوگرافی Affinity Chromatography یکی از دقیق‌ترین و هدفمندترین روش‌ها برای خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب است .این روش  بر اساس برهم‌کنش اختصاصی بین پروتئین هدف و لیگاند ثابت روی ستون عمل می‌کند. در مورد پروتئین‌های دارای His-tag، این برهم‌کنش بین باقی‌مانده‌های هیستیدین پروتئین و یون‌های فلزی مانند نیکل برقرار می‌شود. این ویژگی باعث می‌شود پروتئین موردنظر حتی از میان مخلوط‌های پیچیده‌ای مانند لیزات خام سلولی با بازده و خلوص بالا جداسازی شود.
در فرآیند عملی، نمونه ابتدا روی ستون حاوی رزین Ni-NTA بارگذاری می‌شود و پروتئین هدف به‌طور انتخابی به سطح رزین متصل می‌گردد، در حالی که بیشتر ناخالصی‌ها بدون اتصال از ستون عبور می‌کنند. پس از آن، ستون با بافر شستشو داده می‌شود تا اتصالات غیراختصاصی حذف شوند. در مرحله نهایی، با افزایش کنترل‌شده غلظت ایمیدازول یا تغییر شرایط شیمیایی محیط، پروتئین His-tag از رزین جدا شده و به‌صورت فراکشن‌های مجزا جمع‌آوری می‌شود.
این روش به دلیل سادگی اجرا، سرعت بالا و قابلیت تکرارپذیری، به‌طور گسترده در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، بیوتکنولوژی و تولید پروتئین‌های نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد. کروماتوگرافی تمایلی معمولاً به‌عنوان مرحله اولیه یا میانی خالص‌سازی به کار می‌رود و می‌تواند پیش‌زمینه‌ای مناسب برای مراحل تکمیلی مانند کروماتوگرافی تبادل یونی یا فیلتراسیون ژلی باشد. حفظ ساختار و فعالیت زیستی پروتئین از دیگر مزایای مهم این روش به شمار می‌رود.

اجزای تشکیل‌دهنده دستگاه AKTA Pure روش Affinity

۱. سیستم پمپاژ (High-Precision Pump)
پمپ‌های دقیق دستگاه AKTA Pure وظیفه انتقال بافرها و نمونه را با دبی کاملاً کنترل‌شده بر عهده دارند. در روش Affinity، پایداری جریان اهمیت زیادی دارد، چرا که تغییرات ناگهانی فشار یا دبی می‌تواند باعث کاهش اتصال اختصاصی پروتئین به رزین شود. پمپ‌های چهارتایی دستگاه امکان ترکیب دقیق بافرها و ایجاد گرادیان ایمیدازول را برای مرحله واجذب فراهم می‌کنند.
۲. ورودی نمونه (Sample Injection System)
این بخش شامل لوپ تزریق یا ورودی مستقیم نمونه است که امکان بارگذاری ایمن و یکنواخت لیزات پروتئینی روی ستون را فراهم می‌کند. طراحی این قسمت به‌گونه‌ای است که از ورود حباب هوا جلوگیری شده و نمونه بدون ایجاد تلاطم وارد مسیر کروماتوگرافی می‌شود؛ موضوعی که برای اتصال مؤثر His-tag به رزین بسیار مهم است.
۳. ستون کروماتوگرافی تمایلی (Affinity Column)
ستون‌هایی مانند HisTrap HP قلب اصلی این روش هستند. این ستون‌ها حاوی رزین Ni²⁺-NTA می‌باشند که یون نیکل روی سطح آن‌ها تثبیت شده است. پروتئین‌های دارای برچسب هیستیدینی به‌صورت انتخابی به این یون‌ها متصل می‌شوند، در حالی که سایر پروتئین‌ها و ناخالصی‌ها عبور می‌کنند.
۴. رزین کروماتوگرافی (Ni-Chelating Resin)
رزین مورد استفاده در این روش از ذرات یکنواخت با سطح فعال بالا تشکیل شده که باعث افزایش ظرفیت اتصال و بهبود وضوح جداسازی می‌شود. پایداری شیمیایی رزین امکان شستشوهای مکرر و استفاده مجدد از ستون را بدون افت عملکرد فراهم می‌کند.
۵. آشکارساز UV (UV Detector 280 nm)
آشکارساز UV در طول موج ۲۸۰ نانومتر، عبور پروتئین‌ها از ستون را به‌صورت لحظه‌ای پایش می‌کند. این بخش به کاربر اجازه می‌دهد زمان دقیق واجذب پروتئین هدف را شناسایی کرده و فراکشن‌های مناسب را جمع‌آوری کند. این پایش نقش مهمی در افزایش خلوص نهایی دارد.
۶. سیستم جمع‌آوری فراکشن (Fraction Collector)
فراکشن کالکتور به‌طور خودکار نمونه خروجی از ستون را در لوله‌های جداگانه جمع‌آوری می‌کند. در روش Affinity، این بخش کمک می‌کند تا فقط بخش‌هایی که حاوی پروتئین هدف هستند انتخاب و ذخیره شوند و از اختلاط با ناخالصی‌ها جلوگیری شود.
۷. سنسورهای فشار و هدایت الکتریکی
این سنسورها وضعیت ستون و سیستم را به‌صورت مداوم کنترل می‌کنند. افزایش فشار می‌تواند نشانه گرفتگی ستون باشد و تغییرات هدایت الکتریکی، اطلاعات دقیقی درباره گرادیان ایمیدازول و شرایط واجذب ارائه می‌دهد.
۸. نرم‌افزار کنترلی UNICORN
نرم‌افزار UNICORN مغز کنترلی دستگاه محسوب می‌شود و امکان طراحی، اجرا و ذخیره روش‌های خالص‌سازی را فراهم می‌کند. در روش Affinity، کاربر می‌تواند مراحل تعادل، بارگذاری، شستشو و واجذب را با دقت بالا برنامه‌ریزی کرده و داده‌ها را برای تحلیل‌های بعدی ذخیره کند

نحوه عملکرد دستگاه AKTA Pure در روش کروماتوگرافی Affinity

۱. سیستم پمپاژ (High-Precision Pump)
پمپ‌های دقیق دستگاه AKTA Pure وظیفه انتقال بافرها و نمونه را با دبی کاملاً کنترل‌شده بر عهده دارند. در روش Affinity، پایداری جریان اهمیت زیادی دارد، زیرا تغییرات ناگهانی فشار یا دبی می‌تواند باعث کاهش اتصال اختصاصی پروتئین به رزین شود. پمپ‌های چهارتایی دستگاه امکان ترکیب دقیق بافرها و ایجاد گرادیان ایمیدازول را برای مرحله واجذب فراهم می‌کنند.
۲. ورودی نمونه (Sample Injection System)
این بخش شامل لوپ تزریق یا ورودی مستقیم نمونه است که امکان بارگذاری ایمن و یکنواخت لیزات پروتئینی روی ستون را فراهم می‌کند. طراحی این قسمت به‌گونه‌ای است که از ورود حباب هوا جلوگیری شده و نمونه بدون ایجاد تلاطم وارد مسیر کروماتوگرافی می‌شود؛ موضوعی که برای اتصال مؤثر His-tag به رزین بسیار مهم است.
۳. ستون کروماتوگرافی  (Affinity Column)
ستون‌هایی مانند HisTrap HP قلب اصلی این روش هستند. این ستون‌ها حاوی رزین Ni²⁺-NTA می‌باشند که یون نیکل روی سطح آن‌ها تثبیت شده است. پروتئین‌های دارای برچسب هیستیدینی به‌صورت انتخابی به این یون‌ها متصل می‌شوند، در حالی که سایر پروتئین‌ها و ناخالصی‌ها عبور می‌کنند.
۴. رزین کروماتوگرافی (Ni-Chelating Resin)
رزین مورد استفاده در این روش از ذرات یکنواخت با سطح فعال بالا تشکیل شده که باعث افزایش ظرفیت اتصال و بهبود وضوح جداسازی می‌شود. پایداری شیمیایی رزین امکان شستشوهای مکرر و استفاده مجدد از ستون را بدون افت عملکرد فراهم می‌کند.
۵. آشکارساز UV (UV Detector 280 nm)
آشکارساز UV در طول موج ۲۸۰ نانومتر، عبور پروتئین‌ها از ستون را به‌صورت لحظه‌ای پایش می‌کند. این بخش به کاربر اجازه می‌دهد زمان دقیق واجذب پروتئین هدف را شناسایی کرده و فراکشن‌های مناسب را جمع‌آوری کند. این پایش نقش مهمی در افزایش خلوص نهایی دارد.
۶. سیستم جمع‌آوری فراکشن (Fraction Collector)
فراکشن کالکتور به‌طور خودکار نمونه خروجی از ستون را در لوله‌های جداگانه جمع‌آوری می‌کند. در روش Affinity، این بخش کمک می‌کند تا فقط بخش‌هایی که حاوی پروتئین هدف هستند انتخاب و ذخیره شوند و از اختلاط با ناخالصی‌ها جلوگیری شود.
۷. سنسورهای فشار و هدایت الکتریکی
این سنسورها وضعیت ستون و سیستم را به‌صورت مداوم کنترل می‌کنند. افزایش فشار می‌تواند نشانه گرفتگی ستون باشد و تغییرات هدایت الکتریکی، اطلاعات دقیقی درباره گرادیان ایمیدازول و شرایط واجذب ارائه می‌دهد.
۸. نرم‌افزار کنترلی UNICORN
نرم‌افزار UNICORN مغز کنترلی دستگاه محسوب می‌شود و امکان طراحی، اجرا و ذخیره روش‌های خالص‌سازی را فراهم می‌کند. در روش Affinity، کاربر می‌تواند مراحل تعادل، بارگذاری، شستشو و واجذب را با دقت بالا برنامه‌ریزی کرده و داده‌ها را برای تحلیل‌های بعدی ذخیره کند.

نکات کلیدی در عملکرد AKTA Pure (Affinity – His-tag)

تعادل ستون ضروری است: قبل از بارگذاری نمونه، ستون با بافر تعادل شسته شود تا یون‌های نیکل آماده اتصال اختصاصی باشند.
نمونه باید شفاف و فیلتر شده باشد: وجود ذرات یا لیزات کدر می‌تواند باعث گرفتگی ستون و کاهش بازده شود.
حجم و دبی نمونه کنترل شود: حجم زیاد یا دبی سریع می‌تواند باعث کاهش اتصال پروتئین هدف و کاهش خلوص شود.
شستشوی دقیق ستون: مرحله شستشو باید به‌طور کامل انجام شود تا پروتئین‌های غیر اختصاصی حذف شوند.
گرادیان ایمیدازول کنترل شده باشد: افزایش تدریجی یا مشخص غلظت ایمیدازول باعث آزاد شدن پروتئین هدف بدون از بین رفتن کیفیت آن می‌شود.
پایش UV مداوم: بررسی سیگنال UV در طول فرایند برای تشخیص محل دقیق واجذب پروتئین ضروری است.
جمع‌آوری فراکشن‌های هدف: فقط بخش‌هایی که حاوی پروتئین His-tag هستند باید جمع‌آوری شوند تا خلوص نهایی حفظ شود.
کنترل فشار سیستم: فشار بیش از حد می‌تواند به ستون و رزین آسیب برساند.
شستشو و نگهداری ستون پس از پایان کار: برای استفاده‌های بعدی، ستون باید با بافر مناسب شسته و نگهداری شود.
ثبت داده‌ها و تحلیل کروماتوگرام: نرم‌افزار UNICORN داده‌ها را ذخیره و امکان بررسی و مقایسه فرایندها را فراهم می‌کند.

آموزش کار با دستگاه AKTA Pure در روش کروماتوگرافی Affinity

1.آماده‌سازی اولیه سیستم
بررسی دستگاه
اطمینان از اتصال صحیح ستون Ni-NTA
بررسی سطح بافرها (Equilibration / Wash / Elution)
کنترل فشار مجاز ستون
روشن کردن سیستم
روشن کردن ماژول‌ها و نرم‌افزار کنترل
اجرای دستور Prime برای هواگیری خطوط
تثبیت خط پایه UV در 280 nm
2. آماده‌سازی نمونه
سانتریفیوژ لیزات: 15,000 × g به مدت 30 دقیقه در 4°C
فیلتراسیون با فیلتر 0.22 µm
تنظیم ترکیب نمونه مطابق با بافر تعادلی (وجود 10–20 mM ایمیدازول برای کاهش اتصال غیراختصاصی)
3. تعادل‌سازی ستون (Equilibration)
عبور حداقل 5 CV از بافر تعادلی
اطمینان از پایدار شدن فشار و سیگنال UV
بررسی هدایت الکتریکی (Conductivity) برای تطابق با بافر
4.بارگذاری نمونه (Sample Loading)
تنظیم دبی حدود 0.5 تا 1 mL/min
تزریق نمونه از طریق Sample Loop یا Superloop
پایش افزایش جذب UV هنگام عبور پروتئین‌های غیرمتصل
در این مرحله، پروتئین His-Tag به یون نیکل رزین متصل می‌شود.
5. شستشو (Wash Step)
عبور 5 تا 10 CV از بافر حاوی 20 mM ایمیدازول
حذف پروتئین‌های متصل‌شده ضعیف
بررسی پایدار شدن سیگنال UV پیش از شروع واجذب
6. واجذب (Elution)
تنظیم گرادیان ایمیدازول (مثلاً 20 تا 500 mM طی 10 CV)
پایش پیک اصلی در 280 nm
جمع‌آوری فراکشن‌ها (معمولاً 1 mL در هر لوله)
7. آنالیز و تجمیع فراکشن‌ها
بررسی پیک‌ها در کروماتوگرام
انجام SDS-PAGE برای تأیید خلوص
Pool کردن فراکشن‌های حاوی پروتئین هدف
8. شستشو و نگهداری ستون
شستشو با بافر حاوی ایمیدازول بالا یا محلول Strip (در صورت نیاز)
تعادل مجدد با بافر ذخیره
نگهداری ستون در محلول توصیه‌شده سازنده

نکات مهم ایمنی وعملیاتی