درباره دستگاه مدل AKTA Pure

دستگاه AKTA Pure از شرکت Cytiva آمریکا یک سیستم پیشرفته FPLC برای خالص‌سازی پروتئین‌ها در مقیاس‌های تحقیقاتی و نیمه‌صنعتی است. این دستگاه با بهره‌گیری از پمپ‌های دقیق، آشکارساز UV و نرم‌افزار کنترلی قدرتمند، امکان جداسازی پروتئین‌ها را با دقت بالا و تکرارپذیری مناسب فراهم می‌کند. انعطاف‌پذیری بالای AKTA Pure باعث شده بتوان از آن برای اجرای روش‌های مختلف کروماتوگرافی استفاده کرد و تنها با تغییر ستون و شرایط عملیاتی، فرآیند خالص‌سازی متناسب با نوع نمونه طراحی شود.
یکی از کاربردهای مهم این سیستم، کروماتوگرافی تعویض یونی آنیونی (Anion Exchange) است.روش کروماتوگرافی تعویض یونی آنیونی یکی از پرکاربردترین تکنیک‌ها در خالص‌سازی پروتئین است که جداسازی را بر اساس بار الکتریکی مولکول‌ها انجام می‌دهد. در این روش، فاز ساکن ستون دارای گروه‌های با بار مثبت است که می‌تواند مولکول‌ها یا پروتئین‌های دارای بار منفی را به‌صورت انتخابی جذب کند. از آنجا که بار پروتئین به pH محیط وابسته است، تنظیم دقیق pH نقش کلیدی در موفقیت این روش دارد و امکان کنترل اتصال یا عدم اتصال پروتئین به ستون را فراهم می‌کند.
در فرآیند خالص‌سازی، نمونه پروتئینی ابتدا در شرایطی وارد ستون می‌شود که پروتئین هدف یا ناخالصی‌ها به رزین آنیونی متصل شوند. پس از مرحله شستشو و حذف ترکیباتی که اتصال ضعیفی دارند، جداسازی اصلی با تغییر تدریجی شرایط بافر انجام می‌گیرد. معمولاً افزایش غلظت نمک باعث رقابت یون‌ها با پروتئین‌ها شده و مولکول‌ها بر اساس شدت اتصال خود به‌تدریج از ستون جدا می‌شوند. این روند منجر به تشکیل پیک‌های مجزا در خروجی ستون می‌شود که هر کدام نمایانگر یک جزء خاص از نمونه هستند.
یکی از مزیت‌های مهم کروماتوگرافی Anion Exchange، قدرت تفکیک بالا و انعطاف‌پذیری آن است. این روش نه‌تنها برای حذف ناخالصی‌های باردار، بلکه برای افزایش خلوص نهایی پروتئین در مراحل پایانی خالص‌سازی نیز کاربرد دارد. امکان کنترل دقیق شرایط عملیاتی باعث می‌شود این تکنیک در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، مراکز بیوتکنولوژی و صنایع دارویی به‌عنوان یکی از روش‌های استاندارد و قابل اعتماد مورد استفاده قرار گیرد.

اجزای تشکیل‌دهنده دستگاه AKTA Pure در روش Anion Exchange

بر پروتئین‌ای اجرای کروماتوگرافی تعویض یونی آنیونی، دستگاه AKTA Pure از چند بخش اصلی تشکیل شده است که هر کدام نقش مشخصی در فرآیند خالص‌سازی پروتئین ایفا می‌کنند. هماهنگی دقیق این اجزا باعث می‌شود جداسازیها با دقت بالا و تکرارپذیری مناسب انجام شود.

1. سیستم پمپ چندگانه
پمپ‌های دقیق دستگاه وظیفه تأمین و انتقال بافرها را بر عهده دارند. در روش Anion Exchange، این پمپ‌ها امکان ایجاد گرادیان نمک کنترل‌شده را فراهم می‌کنند که برای جدا شدن تدریجی پروتئین‌ها از رزین آنیونی ضروری است. دقت بالای پمپ‌ها نقش مهمی در پایداری جریان و جلوگیری از نوسانات فشار دارد.
2. واحد اختلاط بافرها (Mixer)
این بخش بافرهای مختلف را قبل از ورود به ستون به‌صورت یکنواخت مخلوط می‌کند. در کروماتوگرافی تعویض یونی، کیفیت اختلاط بافرها مستقیماً بر شکل‌گیری گرادیان نمک و در نتیجه تفکیک پروتئین‌ها تأثیر می‌گذارد.
3. سیستم تزریق نمونه
نمونه پروتئینی از طریق شیر تزریق یا پمپ نمونه وارد دستگاه می‌شود. این بخش امکان کنترل دقیق حجم و سرعت تزریق را فراهم می‌کند و از وارد شدن ناگهانی نمونه که می‌تواند به ستون آسیب بزند جلوگیری می‌کند.
4. ستون کروماتوگرافی Anion Exchange
ستون، بخش کلیدی فرآیند است و شامل رزین‌هایی با بار مثبت می‌باشد که پروتئین‌های دارای بار منفی را جذب می‌کنند. ستون‌هایی مانند HiTrap Q معمولاً برای این روش استفاده می‌شوند و انتخاب صحیح ستون تأثیر مستقیمی بر کیفیت خالص‌سازی دارد.
5. آشکارساز UV
آشکارساز فرابنفش، جذب پروتئین‌ها را معمولاً در طول موج 280 نانومتر اندازه‌گیری می‌کند. این آشکارساز امکان مشاهده لحظه‌ای خروج پروتئین‌ها از ستون و تشخیص پیک‌های مربوط به هر جزء را فراهم می‌سازد.
6. سنسور هدایت الکتریکی
این بخش تغییرات غلظت نمک در بافر خروجی را ثبت می‌کند. در روش Anion Exchange، اندازه‌گیری هدایت برای پایش دقیق گرادیان نمک و ارتباط آن با زمان واجذب پروتئین‌ها اهمیت زیادی دارد.
7. سنسور pH
کنترل و اندازه‌گیری pH خروجی ستون برای اطمینان از ثابت بودن شرایط جداسازی ضروری است، زیرا تغییرات pH می‌تواند بر بار پروتئین و نحوه اتصال آن به رزین تأثیر بگذارد.
8. جمع‌کننده فراکشن (Fraction Collector)
این بخش محلول خروجی از ستون را در لوله‌های مجزا جمع‌آوری می‌کند. هر فراکشن می‌تواند حاوی یک یا چند پروتئین باشد که بعداً برای بررسی خلوص و شناسایی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
9. نرم‌افزار کنترلی UNICORN
نرم‌افزار UNICORN مغز متفکر دستگاه محسوب می‌شود و تمامی اجزای سیستم را هماهنگ می‌کند. طراحی روش، کنترل گرادیان، ثبت داده‌ها و تحلیل نتایج همگی از طریق این نرم‌افزار انجام می‌گیرد.

عملکرد AKTA Pure با روش کروماتوگرافی تعویض یونی آنیونی (Anion Exchange)

روش Anion Exchange بر اساس بار الکتریکی پروتئین‌ها عمل می‌کند. در pH مشخص، پروتئین هدف دارای بار منفی است و به رزین با بار مثبت ستون متصل می‌شود. ناخالصی‌هایی که بار متفاوت دارند یا اتصال ضعیفی دارند از ستون عبور می‌کنند و تنها پروتئین هدف باقی می‌ماند.

مراحل عملکرد دستگاه در این روش:

تعادل ستون (Equilibration): ستون با بافر تعادل شسته می‌شود تا pH و قدرت یونی مناسب برای جذب پروتئین هدف ایجاد شود.

تزریق نمونه (Sample Loading): نمونه پروتئینی وارد ستون می‌شود و پروتئین‌های دارای بار منفی به رزین می‌چسبند، در حالی که ناخالصی‌ها عبور می‌کنند.

شستشو (Wash): بافری مشابه بافر تعادل جریان می‌یابد تا پروتئین‌های غیرهدف و اتصال ضعیف شسته شوند.

استخراج پروتئین هدف (Elution): با تغییر شرایط بافر (افزایش تدریجی غلظت نمک یا تغییر pH)، پروتئین هدف از رزین آزاد می‌شود و از ستون خارج می‌شود.

جمع‌آوری فراکشن‌ها (Fraction Collection): خروجی ستون به لوله‌های جداگانه تقسیم می‌شود تا هر فراکشن حاوی پروتئین‌های مشخص باشد.

پایش لحظه‌ای (Monitoring): آشکارساز UV در طول موج 280 نانومتر جریان خروجی را پایش می‌کند تا محل جداسازی پروتئین هدف مشخص شود.

شستشو و نگهداری ستون (Cleaning & Storage): پس از اتمام جداسازی، ستون با بافر مناسب شسته شده و برای استفاده بعدی آماده می‌شود.

نکات کلیدی عملکرد
قدرت تفکیک بالا و خلوص زیاد پروتئین به دلیل وابستگی بار پروتئین به pH و گرادیان نمک
کنترل دقیق جریان و فشار توسط پمپ‌ها و نرم‌افزار UNICORN
جمع‌آوری دقیق فراکشن‌ها و ثبت کامل داده‌ها برای اطمینان از کیفیت خالص‌سازی
در مجموع، AKTA Pure با روش Anion Exchange امکان خالص‌سازی هدفمند پروتئین‌های باردار منفی را با دقت، تکرارپذیری و سرعت بالا فراهم می‌کند.

آموزش کار با دستگاه AKTA Pure – روش Anion Exchange
دستگاه AKTA Pure یک سیستم مدرن FPLC برای خالص‌سازی پروتئین‌ها است. در این راهنما، مراحل کار با دستگاه برای روش کروماتوگرافی تعویض یونی آنیونی به صورت مرحله‌به‌مرحله توضیح داده شده است.
۱. آماده‌سازی نمونه و بافرها
محلول پروتئین را سانتریفیوژ کنید تا ذرات معلق جدا شوند (حدود 15,000 × g برای 30 دقیقه در 4°C).
نمونه را از فیلتر 0.22 میکرومتر عبور دهید تا هرگونه ذره باقی‌مانده حذف شود.
pH نمونه را با بافر تعادل (20 mM Tris-HCl، pH 8.0) تنظیم کنید.
بافرهای تعادل و واجذب را آماده کرده و در مخازن دستگاه قرار دهید.
۲. راه‌اندازی ستون
ستون HiTrap Q HP را نصب کنید و شیرهای ورودی و خروجی را چک کنید.
ستون را با 5 حجم ستون (CV) بافر تعادل شستشو دهید تا شرایط پایدار شود.
از نرم‌افزار UNICORN برای تعریف روش و تنظیم پارامترهای جریان و گرادیان استفاده کنید.
۳. تزریق نمونه و بارگذاری
نمونه پروتئین را وارد پمپ تزریق یا شیر نمونه کنید.
با سرعت 1–2 mL/min نمونه را روی ستون بارگذاری کنید.
توجه کنید فشار ستون در محدوده مجاز باقی بماند تا رزین آسیب نبیند.
۴. شستشو و حذف ناخالصی‌ها
ستون را با 5 CV بافر تعادل شستشو دهید.
این مرحله باعث حذف پروتئین‌های غیرهدف و ترکیبات با اتصال ضعیف می‌شود.
جریان UV در طول موج 280 nm را بررسی کنید تا شستشو کامل باشد.
۵. واجذب و استخراج پروتئین هدف
با استفاده از نرم‌افزار، گرادیان خطی 0–1 M NaCl را روی 20 CV اعمال کنید.
پروتئین هدف با افزایش نمک به تدریج از ستون آزاد می‌شود.
خروجی ستون را به جمع‌کننده فراکشن هدایت کنید و هر فراکشن 1 mL جمع‌آوری شود.
۶. بررسی و جمع‌آوری نهایی
فراکشن‌های جمع‌آوری‌شده را با SDS-PAGE یا اندازه‌گیری UV بررسی کنید.
فراکشن‌های حاوی پروتئین هدف را با هم Pool کنید.
در صورت نیاز، پروتئین را با فیلتر سانتریفیوژ یا روش تغلیظ آماده استفاده کنید.
۷. شستشو و نگهداری ستون
ستون را با بافر شستشو تمیز کنید.
ستون را در شرایط توصیه‌شده سازنده نگهداری کنید تا برای استفاده بعدی آماده باشد.
نرم‌افزار UNICORN را برای ذخیره داده‌ها و پایان کار ببندید.

نکات مهم ایمنی و عملیاتی

همیشه فشار ستون و دما را کنترل کنید.
از آلودگی ستون و بافرها جلوگیری کنید.
گرادیان نمک را با دقت برنامه‌ریزی کنید تا جداسازی دقیق انجام شود.
فراکشن‌ها را بلافاصله پس از جمع‌آوری در 4°C نگهداری کنید.