درباره دستگاه مدل AKTA Pure

دستگاه خالص‌سازی پروتئین به روش Anion Exchange Pilot Scale با استفاده از سیستم ‌AKTA Pure یکی از راهکارهای حرفه‌ای برای جداسازی و تغلیظ پروتئین‌های دارای بار منفی در مقیاس نیمه‌صنعتی محسوب می‌شود. این پلتفرم پیشرفته ساخت شرکت Cytiva آمریکا بوده و در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، مراکز بیوتکنولوژی و واحدهای تولیدی کاربرد گسترده‌ای دارد. در این روش، جداسازی بر اساس اختلاف بار الکتریکی مولکول‌ها انجام می‌شود و امکان دستیابی به خلوص بالا با حفظ ساختار و فعالیت زیستی پروتئین فراهم می‌گردد.
در تکنیک Anion Exchange، زمانی که pH محیط بالاتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین تنظیم شود، پروتئین هدف دارای بار منفی خواهد بود و به رزین‌های تبادل یونی قوی مانند Q Sepharose متصل می‌شود. پس از مرحله شستشو برای حذف ناخالصی‌های غیرمتصل، افزایش کنترل‌شده غلظت نمک (مانند NaCl) باعث آزادسازی تدریجی پروتئین از ستون می‌شود. پایش هم‌زمان جذب نوری در طول موج 280 نانومتر امکان تشخیص دقیق پیک‌های پروتئینی و جمع‌آوری فراکشن‌های خالص را فراهم می‌کند، که این موضوع نقش مهمی در بهینه‌سازی فرآیند خالص‌سازی دارد.
مدل AKTA Pure در مقیاس پایلوت با طراحی ماژولار، پمپ‌های دقیق چهارکاناله و کنترل نرم‌افزاری پیشرفته، امکان اجرای گرادیان‌های دقیق و تکرارپذیری بالا را فراهم می‌کند. این ویژگی‌ها سبب شده است تا این سیستم برای خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب، تولید مواد بیولوژیک و انجام مراحل میانی فرآیندهای بیوفارما گزینه‌ای قابل اعتماد باشد. ترکیب دقت، ظرفیت مناسب و کنترل کامل بر شرایط عملیاتی، این روش را به انتخابی ایده‌آل برای مراکزی تبدیل کرده که به دنبال افزایش بهره‌وری و کیفیت در خالص‌سازی پروتئین هستند.

 

اجزای تشکیل دهنده دستگاه AKTA Pure در روش Anion Exchange Pilot Scale

در روش Anion Exchange Pilot Scale، دستگاه ÄKTA pure از چند بخش اصلی و هماهنگ تشکیل شده است که هر کدام نقش مشخصی در فرآیند خالص‌سازی پروتئین دارند. در ادامه اجزای تشکیل‌دهنده سیستم در این روش به‌صورت کاربردی توضیح داده شده است.

1. پمپ چهارکاناله دقیق (Quaternary Pump)
قلب سیستم محسوب می‌شود و وظیفه انتقال بافرها با دبی یکنواخت و ایجاد گرادیان نمک (مثلاً 0 تا 1 مولار NaCl) را بر عهده دارد. دقت بالای این پمپ برای جداسازی صحیح بر اساس بار الکتریکی بسیار حیاتی است.

2. سیستم ورودی نمونه (Sample Injection System)
شامل لوپ تزریق یا پمپ نمونه است که امکان ورود کنترل‌شده محلول پروتئینی به ستون را فراهم می‌کند. در مقیاس پایلوت، حجم تزریق می‌تواند بیشتر از حالت تحقیقاتی باشد.

3. ستون کروماتوگرافی تبادل یونی
در این روش معمولاً از ستون‌های حاوی رزین Q Sepharose HP استفاده می‌شود. این ستون محل اصلی جداسازی است و پروتئین‌های دارای بار منفی به گروه‌های عاملی مثبت رزین متصل می‌شوند.

4.آشکارساز UV (UV Detector 280 nm)
برای پایش لحظه‌ای خروج پروتئین از ستون استفاده می‌شود. جذب در طول موج 280 نانومتر نشان‌دهنده حضور پروتئین در جریان خروجی است و پیک‌های کروماتوگرام را ایجاد می‌کند.

5. سنسورهای فشار (Pressure Sensors)
فشار داخل ستون را کنترل می‌کنند تا از آسیب به رزین یا سیستم جلوگیری شود، به‌ویژه در مقیاس پایلوت که حجم و دبی بالاتر است.

6. سنسور هدایت الکتریکی (Conductivity Monitor)
برای اندازه‌گیری تغییرات غلظت نمک در هنگام اجرای گرادیان استفاده می‌شود و تأیید می‌کند که شیب نمک به‌درستی اعمال شده است.

7.سنسور pH
در برخی تنظیمات برای کنترل دقیق شرایط شیمیایی حین خالص‌سازی به کار می‌رود.

8. کلکتور فراکشن (Fraction Collector)
بخش خروجی سیستم که محلول‌های جداشده را در لوله‌های مجزا جمع‌آوری می‌کند. تنظیم آن می‌تواند بر اساس حجم، زمان یا شدت پیک UV انجام شود.

9.شیرهای انتخابی (Valves)
برای هدایت مسیر جریان بین بافرها، ستون، بای‌پس و شستشو استفاده می‌شوند و امکان اجرای مراحل تعادل، بارگذاری، شستشو و واجذب را فراهم می‌کنند.

10.نرم‌افزار کنترل (UNICORN)
سیستم توسط نرم‌افزار UNICORN کنترل می‌شود که امکان برنامه‌ریزی گرادیان، تنظیم دبی، مانیتورینگ آنلاین و ذخیره داده‌های کروماتوگرام را فراهم می‌کند.

در مجموع، تمام این اجزا به‌صورت یکپارچه کار می‌کنند تا در روش Anion Exchange Pilot Scale جداسازی بر اساس اختلاف بار الکتریکی با دقت، تکرارپذیری و بازده بالا انجام شود.

نحوه عملکرد دستگاه Akta Pure با روش Anion Exchange Pilot Scale 

در روش Anion Exchange Pilot Scale با استفاده از سیستم ÄKTA pure، فرآیند خالص‌سازی بر اساس اختلاف بار الکتریکی پروتئین‌ها انجام می‌شود. در ادامه، عملکرد دستگاه به‌صورت مرحله‌به‌مرحله و کاملاً کاربردی توضیح داده شده است:
 آماده‌سازی سیستم و ستون
ابتدا مسیرهای جریان با بافر تعادل (مثلاً 20 mM Tris-HCl، pH 8.0) شسته می‌شوند تا هوا از خطوط خارج شده و سیستم پایدار شود. سپس ستون حاوی رزین Q (تبادل یونی قوی) به دستگاه متصل می‌شود. دستگاه با عبور چند حجم ستونی (CV) از بافر تعادل، محیط یونی ستون را تثبیت می‌کند تا شرایط اتصال پروتئین فراهم شود.
 تنظیم پارامترهای عملیاتی
در نرم‌افزار دستگاه، دبی جریان (مثلاً 2 mL/min)، حجم تزریق، شیب گرادیان نمک (0 تا 1 مولار NaCl) و نحوه جمع‌آوری فراکشن‌ها تعریف می‌شود. سنسورهای فشار، هدایت الکتریکی و UV فعال می‌شوند تا فرآیند به‌صورت لحظه‌ای پایش گردد.
 بارگذاری نمونه (Sample Loading)
نمونه پروتئینی که قبلاً سانتریفیوژ و فیلتر شده است، وارد ستون می‌شود. اگر pH بافر بالاتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین باشد، پروتئین دارای بار منفی خواهد بود و به گروه‌های عاملی مثبت رزین متصل می‌شود. ترکیبات فاقد بار مناسب یا ناخالصی‌ها بدون اتصال از ستون عبور می‌کنند.
شستشوی ستون (Wash Step)
پس از پایان بارگذاری، همان بافر تعادل از ستون عبور داده می‌شود تا هرگونه اتصال ضعیف یا غیراختصاصی حذف گردد. در این مرحله سیگنال UV معمولاً کاهش یافته و به خط پایه نزدیک می‌شود که نشان‌دهنده خروج ناخالصی‌هاست.
 واجذب با گرادیان نمک (Elution)
در این مرحله دستگاه به‌صورت خودکار گرادیان افزایشی NaCl ایجاد می‌کند. با افزایش قدرت یونی، یون‌های کلرید با پروتئین برای اتصال به رزین رقابت می‌کنند. پروتئین‌هایی که اتصال ضعیف‌تری دارند زودتر جدا می‌شوند و پروتئین‌های با اتصال قوی‌تر در غلظت‌های نمک بالاتر آزاد می‌گردند. این جداسازی به‌صورت پیک‌های مشخص در کروماتوگرام UV ظاهر می‌شود.
 پایش و جمع‌آوری فراکشن‌ها
آشکارساز UV در طول موج 280 نانومتر حضور پروتئین را تشخیص می‌دهد. دستگاه بر اساس تنظیمات از پیش تعیین‌شده، محلول خروجی را در لوله‌های مجزا جمع‌آوری می‌کند. اپراتور می‌تواند بر اساس شکل پیک‌ها و نتایج SDS-PAGE فراکشن‌های مناسب را انتخاب و ترکیب کند.
 شستشو و احیای ستون
پس از اتمام جداسازی، ستون با بافر حاوی نمک بالا شسته می‌شود تا هرگونه پروتئین باقی‌مانده حذف گردد. سپس با بافر نگهدارنده مناسب تعادل برقرار شده و ستون برای استفاده بعدی آماده می‌شود.
جمع‌بندی عملکرد سیستم
در این روش، دستگاه با کنترل دقیق دبی، گرادیان نمک، فشار و سیگنال UV، امکان جداسازی انتخابی پروتئین‌های دارای بار منفی را در مقیاس پایلوت فراهم می‌کند. هماهنگی بین پمپ‌ها، سنسورها و نرم‌افزار کنترلی باعث می‌شود فرآیند خالص‌سازی با دقت بالا، تکرارپذیری مناسب و حداقل اتلاف نمونه انجام شود.

نکات کلیدی عملکرد:

pH باید بالاتر از نقطه ایزوالکتریک (pI) پروتئین باشد تا پروتئین بار منفی گرفته و به رزین متصل شود. انتخاب نادرست pH باعث عدم اتصال یا کاهش بازده می‌شود.

هدایت پایین در مرحله تعادل و بارگذاری ضروری است؛ افزایش کنترل‌شده هدایت در مرحله واجذب، جداسازی دقیق‌تر پیک‌ها را تضمین می‌کند.

گرادیان خطی NaCl باید بدون نوسان ایجاد شود؛ هرگونه اختلال در عملکرد پمپ می‌تواند باعث اعوجاج پیک‌ها شود.

در مقیاس پایلوت به دلیل حجم و دبی بالاتر، افزایش فشار ممکن است رخ دهد. فشار بیش از حد می‌تواند به رزین آسیب بزند یا موجب افت عملکرد شود.

حجم و غلظت نمونه نباید از ظرفیت رزین بیشتر باشد؛ اضافه‌بارگذاری باعث افت خلوص و پهن شدن پیک‌ها می‌شود.

مرحله Wash نقش مهمی در حذف اتصالات ضعیف دارد و مستقیماً بر خلوص نهایی تأثیر می‌گذارد.

شکل، ارتفاع و پهنای پیک‌ها اطلاعات ارزشمندی درباره خلوص، ظرفیت ستون و کارایی جداسازی ارائه می‌دهد.

نوسان دما می‌تواند بر ساختار پروتئین و رفتار یونی آن تأثیر بگذارد، به‌ویژه در مقیاس بالاتر.

شستشو با نمک بالا و ذخیره‌سازی در بافر مناسب باعث افزایش طول عمر رزین می‌شود.

ذخیره کروماتوگرام‌ها و پارامترها امکان بهینه‌سازی و مقایسه بین بچ‌های مختلف را فراهم می‌کند.

آموزش کاربا دستگاه Akta Pure با روش Anion Exchange Pilot Scale 

مرحله 1: آماده‌سازی اولیه سیستم
دستگاه را روشن کنید و از اتصال صحیح ستون Q Sepharose HP اطمینان حاصل نمایید.
خطوط بافر A (بافر تعادل) و بافر B (بافر حاوی 1M NaCl) را به ورودی پمپ متصل کنید.
از نبودن هوا در خطوط اطمینان حاصل کنید (Prime کردن پمپ‌ها).
سنسورهای UV، فشار و Conductivity را بررسی و صفر (Zero) کنید.

مرحله 2: تنظیم متد در نرم‌افزار
یک متد جدید برای Anion Exchange تعریف کنید.
دبی جریان را (مثلاً 2 mL/min) تنظیم نمایید.
مراحل متد را به ترتیب مشخص کنید:
Equilibration (۵ CV با بافر A)
Sample Loading
Wash (۵–۱۰ CV با بافر A)
Gradient Elution (۰ تا ۱۰۰٪ بافر B طی ۲۰ CV)
Column Cleaning
نحوه جمع‌آوری فراکشن‌ها را بر اساس حجم (مثلاً 1–2 mL) یا سیگنال UV تعیین کنید.

مرحله 3: تعادل ستون
متد را اجرا کنید تا ستون با بافر تعادل شسته شود.
زمانی که هدایت الکتریکی و UV به خط پایه پایدار رسیدند، ستون آماده بارگذاری است.

مرحله 4: بارگذاری نمونه
نمونه را که قبلاً سانتریفیوژ و فیلتر 0.22 µm شده است، در ورودی نمونه قرار دهید.
بارگذاری را با دبی مشخص انجام دهید.
در این مرحله پروتئین‌های دارای بار منفی به رزین متصل می‌شوند و ناخالصی‌ها عبور می‌کنند.

مرحله 5: شستشو (Wash)
پس از اتمام بارگذاری، سیستم با همان بافر تعادل ستون را شستشو می‌دهد.
این مرحله برای حذف اتصال‌های ضعیف ضروری است.
سیگنال UV باید به سطح پایه نزدیک شود.

مرحله 6: واجذب با گرادیان نمک
گرادیان افزایشی NaCl آغاز می‌شود.
با افزایش قدرت یونی، پروتئین‌ها بر اساس شدت اتصالشان جدا می‌شوند.
پیک‌های UV در 280 nm ظاهر می‌شوند.
فراکشن کالکتور به‌صورت خودکار نمونه‌ها را جمع‌آوری می‌کند.

مرحله 7: پایان کار و احیای ستون
پس از اتمام واجذب، ستون را با 100٪ بافر B شستشو دهید.
سپس با بافر نگهدارنده مناسب تعادل برقرار کنید.
داده‌ها را ذخیره کرده و کروماتوگرام را بررسی نمایید.

نکات عملی مهم
قبل از هر ران، فشار ستون را چک کنید.
از تطابق pH نمونه با بافر تعادل اطمینان حاصل کنید.
از اضافه‌بارگذاری ستون خودداری نمایید.
همیشه پس از پایان کار، ستون را طبق دستورالعمل سازنده نگهداری کنید.