تشخیص ویروس HPV با استفاده از دستگاه Real-Time PCR

معرفی روشهای نوین تشخیص hpv

یکی از عوامل اصلی سرطان دهانه رحم ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) می باشد. میزان بروز و مرگ‌ ومیر سرطان دهانه رحم حتی با وجود برنامه‌های غربالگری و واکسیناسیون HPV، هنوز هم بالا است، روش قدیمی مانند روش پاپ‌اسمیر (pop test) سال‌ها به عنوان مهمترین روش غربالگری ضایعات پیش‌سرطانی دهانه رحم بود و حتی توانست به کاهش شیوع سرطان کمک کند. اما این روش در شناسایی مستقیم ویروس عاجز است و بازدهی پایینی دارد. در مقابل، آزمایش‌های مولکولی DNA ویروس HPV حساسیت بسیار بالاتری (بیش از ۹۰٪) در شناسایی ضایعات پرخطر نشان داده‌اند. بر همین اساس، امروزه آزمایش‌های تشخیص مستقیم HPV به عنوان راهبردی مؤثرتر برای غربالگری سرطان دهانه رحم مطرح شده‌اند. با این وجود، بسیاری از تست‌های تجاری HPV موجود در بازار نسبتاً پرهزینه، زمان‌بر و نیازمند تجهیزات پیشرفته آزمایشگاهی هستند که کاربرد وسیع آن‌ها را محدود می‌کند. برای غلبه بر این چالش‌ها، در سال‌های اخیر روش‌های نوینی توسعه یافته‌اند که هدفشان ساده‌تر، سریع‌تر و ارزان‌تر کردن تشخیص HPV است. در ادامه، مهم‌ترین روش‌های نوین تشخیص HPV را معرفی کرده، به‌ویژه به روش Real-Time PCR می‌پردازیم و ضمن تشریح نحوه عملکرد هر کدام، دقت و نقاط قوت و ضعف آن‌ها را مقایسه می‌کنیم.

روش‌های سنتی تشخیص HPV و محدودیت‌های آن‌ها

سیتولوژی دهانه رحم یا پاپ‌اسمیر(pop smear): در این روش یک نمونه از سلولهای دهانه رحم رنگ‌آمیزی و تغییرات پیش‌سرطانی آنها به وسیله میکروسکوپ بررسی می‌شوند. تست پاپ روش بسیار اختصاصی در تشخیص ضایعه دهانه رحم است، اما حساسیت آن پایین می باشد (حدود ۵۵٪). به بیان دیگر، پاپ‌اسمیر بسیاری از موارد ضایعات ناشی از HPV را منفی کاذب گزارش می‌کند و برای جبران این ضعف باید به‌طوراین روش مکررا انجام شود. این محدودیت موجب شده است که pop smear بسیاری از عفونت پرخطر HPV را تشخیص ندهد، در حالی‌که آزمایش‌هایی مانند HPV-DNA می‌توانند براحتی تشخیص دهند. امروزه در بسیاری از کشورها تست HPV به‌عنوان جایگزین یا مکمل پاپ‌اسمیر در برنامه غربالگری توصیه می‌شود.

آزمون Hybrid Capture II: یک روش تست قدیمی تشخیص HPV این روش بود. این روش بر پایه هیبریدی‌سازی اسید نوکلئیک طراحی شد. در تست Hybrid Capture 2 (HC2)، ابتدا DNA ویروس HPV در نمونه به کمک کاوشگر‌های RNA اختصاصی هیبرید شده و تشکیل هیبرید RNA-DNA می‌دهد. این هیبریدها سپس توسط آنتی‌بادی‌های متصل به آنزیم جدا می شود. سپس به انها معرفهایی اضافه شده و با روش لومینسانس آشکارسازی می شوند. نتیجه به صورت سیگنال نوری نسبی گزارش می‌شود که نشان‌دهنده بار ویروسی تقریبی است. مزیت اصلی روش HC2 این است که تمام ژنوتیپ‌های پرخطر HPV را به صورت تجمیعی شناسایی می‌کند و در مطالعات اولیه نقش مهمی در ورود تست HPV به عرصه بالین داشته است. حساسیت بالینی Hybrid Capture برای ضایعات پرخطر قابل‌قبول (حدود ۸۵–۹۵٪) و ارزش پیش‌بینی منفی آن بسیار عالی است، به طوری که یک نتیجه منفی این تست تقریباً به معنای عدم وجود ضایعه پرخطر است. با این حال، نقاط ضعفی نیز دارد: اولا حساسیت تحلیلی (analytic sensitivity) آن نسبت به روش‌های مبتنی بر PCR پایین‌تر است و در مواردی با بار ویروسی کم یا عفونت‌های نهفته ممکن است نتیجه منفی کاذب بدهد. مطالعات نشان داده‌اند که روش‌های PCR می‌توانند موارد بیشتری از عفونت HPV را در نمونه‌هایی با تغییرات خفیف یا حتی سیتولوژی نرمال کشف کنند که HC2 قادر به شناسایی آن‌ها نیست. به عنوان مثال، در یک مطالعه HC2 هفت مورد ضایعه پره‌سرطانی (CIN2+) را که PCR آن‌ها را مثبت یافته بود، تشخیص نداد. ثانیاً، تست HC2 نمی‌تواند ژنوتیپ مشخص ویروس را تعیین کند ( فقط نشان می‌دهد HPV پرخطر حضور دارد یا خیر) و برای تعیین نوع HPV نیاز به آزمون تکمیلی است. در نهایت، با ظهور روش‌های دقیق‌تر و توانمندتر، کاربرد HC2 به تدریج رو به کاهش است، هرچند که همچنان در برخی آزمایشگاه‌ها و مطالعات اپیدمیولوژیک به‌عنوان یک استاندارد مقایسه استفاده می‌شود.

PCR سنتی (نیمه‌کمی یا مبتنی بر ژل): از حدود سی سال پیش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تشخیص HPV به کار گرفته شد. روش‌های PCR مرسوم معمولاً از پرایمرهای عمومی GP5+ و GP6+ برای تکثیر ناحیه حفاظت‌شده‌ای از ژنوم ویروس HPV استفاده می‌کنند. محصول PCR سپس با روش ژل الکتروفورز مشاهده می‌شود. مزیت PCR سنتی حساسیت تحلیلی بالا و قابلیت genotyping است. از طرف دیگر محدودیت‌های آن شامل فرآیند چندمرحله‌ای وقت‌گیر، خطر آلودگی محیط به محصول تکثیری و عدم امکان تعیین آسان بار ویروس است.

روش Real-Time PCR

یکی از موثرترین و پرکاربردترین روش‌های نوین تشخیص Real-Time PCR یا QPCR است. در این روش، DNA ویروس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی در حضور کاوشگر یا رنگ فلورسنت تکثیر می‌شود و سیگنال فلورسنت در هر چرخه اندازه‌گیری می‌گردد. زمانی‌که مقدار محصول تکثیری از آستانه معینی بگذرد، سیگنال ثبت شده و Ct (آستانه چرخه) تعیین می‌شود. به این ترتیب Real-Time PCR امکان تشخیص کیفی حضور HPV و اندازه‌گیری نسبی کمی بار ویروس را در یک مرحله فراهم می‌کند.

نحوه عملکرد و راه‌اندازی:

برای انجام Real-Time PCR جهت شناسایی HPV، مراحل زیر طی می‌شود:

نمونه‌گیری: معمولاً از سلول‌های دهانه رحم به وسیله براش سرویکال (Cervix brush) نمونه گرفته می‌شود. نمونه می‌تواند در محیط‌های نگهدارنده مایع مانند ThinPrep ذخیره می گردد. سپس DNA ژنومی شامل DNA ویروس HPV از سلول‌های نمونه جدا می‌شود. این کار با کیت‌های استخراج DNA یا روش‌هایی مانند فنل-کلروفرم و همچنین ستون‌های سیلیکا انجام می‌گیرد. کیفیت و کمیت DNA استخراج‌شده می‌تواند بر نتیجه PCR اثرگذار باشد. در میکروتیوب PCR، اجزای لازم ترکیب می‌شوند. اجزا شامل DNA الگو، پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌های هدف HPV ، کاوشگر فلورسنت ، مسترمیکس حاوی آنزیم DNA پلیمراز گرمادوست، نوکلئوتیدها و یون منیزیم می باشد. میکروتیوپ در دستگاه ترموسایکلر Real-Time قرار می‌گیرد. برنامه حرارتی شامل مراحل دناتوراسیون DNA (مثلاً 95°C) و اتصال پرایمر (مثلاً 60°C) در چرخه‌های متوالی انجام می گیرد. با تکثیر هدف، پروب فلورسنت تجزیه شده و انتشار فلورسانس در هر چرخه توسط دستگاه ثبت می‌شود. در نهایت، دستگاه PCR نمودار افزایش سیگنال را رسم می‌کند. اگر نمونه HPV پرخطر داشته باشد، منحنی فلورسنت آن از خط پایه عبور کرده Ct مشخصی می‌دهد. Ct پایین‌تر به معنای بار ویروسی بالاتر است. نمونه‌های فاقد HPV پرخطر سیگنال معناداری تولید نمی‌کنند. برای اطمینان از صحت، کنترل‌های مثبت (حاوی DNA HPV) و کنترل منفی (آب یا بافر بدون DNA) در هر ران گنجانده می‌شود. همچنین جهت اطمینان از وجود DNA و عدم مهار واکنش، یک ژن کنترل داخلی (مانند ژن بتاگلوبین انسانی) اغلب در واکنش مورد ارزیابی قرار می گیرد.

دقت و قابلیت اطمینان:

Real-Time PCR به عنوان روش مرجع تشخیص HPV از حساس‌ترین و اختصاصی‌ترین روش‌ها است. مطالعات تطبیقی نشان داده‌اند که سنجش‌های Real-Time PCR توان تشخیص ویروس را با حساسیت و ویژگی بالاتری نسبت به PCR سنتی انجام می‌دهند. به عبارتی، حد تشخیص (LOD) در Real-Time PCR پایین‌تر و قدرت تفکیک آن بیشتر است؛ به طور مثال گزارش شده که حساسیت qPCR برای شناسایی HPV16 تا حد ۰٫۴۶ نسخه در هر سلول (معادل حدود 10 نسخه در میکرولیتر) می‌باشد که در مقایسه با PCR سنتی به مراتب برتر است. همچنین اختصاصیت بالای پروب‌های فلورسنت باعث کاهش موارد مثبت کاذب ناشی از اتصال غیراختصاصی پرایمرها می‌شود، به طوری که qPCR نسبت به PCR مرسوم نرخ مثبت کاذب بالینی را کاهش می‌دهد. در یک مطالعه که روش Real-Time PCR چندگانه برای ۱۵ ژنوتیپ پرخطر HPV را با روش PCR همراه هیبریداسیون معکوس (PCR-RDB) مقایسه کرد، مشخص شد که دقت تشخیصی (accuracy) Real-Time PCR حدود ۹۹٫۷٪ است، در حالی‌که این رقم برای روش قدیمی‌تر RDB حدود ۹۸٪ بو. هرچند این اختلاف جزئی به نظر می‌رسد، اما نشان‌دهنده حساسیت و ویژگی کمی بالاتر Real-Time PCR است. به علاوه، توانایی Real-Time PCR در ارائه اطلاعات کمی (بار ویروس) یک مزیت مهم است، زیرا بار ویروس HPV می‌تواند با خطر پیشرفت ضایعه مرتبط باشد؛ مثلاً مشاهده شده که اندازه‌گیری تعداد نسخه‌های HPV به تفکیک ژنوتیپ به مدیریت بیماران کمک می‌کند.

لوازم مصرفی و ملزومات اجرایی:

• دستگاه Real-Time PCR: یک ترموسایکلر کمّی مجهز به منبع نور و دتکتور فلورسانس برای ثبت سیگنال است.
• کیت تشخیص HPV: شامل مسترمیکس PCR (حاوی آنزیم Taq پلیمراز مقاوم به حرارت، dNTP، بافر و کوفاکتورها)، پرایمرهای اختصاصی ژن‌های هدف HPV (و پرایمر کنترل داخلی)، کاوشگرهای فلورسنت علامت‌دار (برای انواع HPV یا گروه پرخطر)، و گاهی مواد کنترل مثبت و منفی. این کیت‌ها توسط شرکت‌های مختلف تولید می‌شوند. (در این مقاله از ذکر نام کیت‌های تجاری خاص خودداری می‌کنیم).
• مواد مصرفی عمومی: نوک سمپلر یک‌بار مصرف فیلتردار (جهت جلوگیری از آلودگی)، میکروتیوب‌های مخصوص PCR یا پلیت‌های ۹۶ خانه سازگار با دستگاه، کاورها یا چسب‌های پوشاننده پلیت، دستکش و روپوش آزمایشگاهی (جهت جلوگیری از آلودگی نمونه‌ها).
• فضای کار و تجهیزات جانبی: هود PCR (اتاقک تمیز برای آماده‌سازی واکنش‌ها به دور از منابع DNA خارجی)، سانتریفیوژ کوچک (برای ته‌نشین کردن محتویات تیوب‌ها)، ویورتکس (برای مخلوط کردن)، و فریزر جهت نگهداری آنزیم‌ها و مواد حساس به دما. همچنین دستگاه استخراج DNA (خودکار یا دستی) به‌همراه کیت‌های استخراج جزو ملزومات شروع فرآیند است.

مزایای Real-Time PCR:

ترکیب عوامل فوق باعث شده که Real-Time PCR به روشی سریع، دقیق و تکرارپذیر برای تشخیص HPV تبدیل شود. این روش ذاتاً بسته است (نیازی به باز کردن لوله پس از تکثیر نیست) و بنابراین خطر آلودگی متقاطع را کاهش می‌دهد. نتایج آن به صورت دیجیتال و کمّی در دسترس است و تفسیر آسان‌تری نسبت به باندهای ژل الکتروفورز دارد. از نظر زمان، بسیاری از آزمون‌های qPCR در مدت حدود ۱ الی ۲ ساعت تکمیل می‌شوند و برخی دستگاه‌های خودکار جدید امکان انجام همزمان استخراج و PCR را فراهم کرده‌اند که گردش کار را تسریع می‌کند. هزینه هر تست Real-Time PCR با در نظر گرفتن reagents و استهلاک دستگاه، در مطالعات کمتر از ۱۰ دلار گزارش شده است، که با توجه به ظرفیت انجام تعداد زیادی تست در روز مقرون‌به‌صرفه و مناسب برنامه‌های غربالگری انبوه است. همچنین امکان multiplex کردن (تکثیر چندین هدف در یک واکنش) باعث می‌شود چندین ژنوتیپ HPV یا حتی ترکیبی از عوامل بیماری‌زا را در یک نمونه به طور همزمان سنجید. به طور خلاصه، Real-Time PCR اکنون به عنوان استاندارد طلایی تشخیص HPV شناخته می‌شود، چرا که حساسیت حدود ۹۵–۹۹٪ و ویژگی نزدیک ۹۹٪ را در شناسایی عفونت‌های HPV پرخطر نشان داده است. این سطح دقت بالا تضمین می‌کند که آزمایش منفی کاذب به حداقل برسد و موارد کمتری از عفونت‌های پرخطر از دست بروند.

ملاحظات و محدودیت‌ها:

اگرچه Real-Time PCR روشی بسیار کارآمد است، اما نیاز به سرمایه‌گذاری اولیه برای دستگاه و آموزش پرسنل دارد. تجهیزات Real-Time PCR نسبتاً گران‌قیمت هستند و تامین و نگهداری آن‌ها ممکن است برای هر آزمایشگاه کوچکی مقدور نباشد. علاوه بر این، هرچند مدت زمان اجرای تست کوتاه است، اما روند استخراج DNA و آماده‌سازی نمونه‌ها هنوز می‌تواند مرحله زمان‌بری باشد (مگر آنکه از دستگاه‌های تمام‌خودکار استفاده شود). به همین دلیل، پژوهشگران به دنبال روش‌های ساده‌تری هستند که شاید نیاز به ترموسایکلر نداشته باشند یا قابل حمل باشند؛ این امر ما را به سایر روش‌های نوین تشخیص HPV رهنمون می‌سازد که در بخش بعدی بررسی می‌شوند.

سایر روش‌های نوین تشخیص HPV

فراتر از Real-Time PCR، تکنیک‌های جدیدی برای تشخیص HPV ابداع شده‌اند که برخی در مرحله پژوهشی و برخی در حال ورود به بازار هستند. این روش‌ها هر یک می‌کوشند بر چالش‌های روش‌های موجود غلبه کنند (مثلاً ساده‌سازی تجهیزات، کاهش هزینه یا افزایش دقت). در این بخش به چند دسته مهم از این نوآوری‌ها می‌پردازیم و نقاط قوت و ضعف آن‌ها را مرور می‌کنیم:

تکثیر هم‌دما (LAMP و RPA)

تکنیک‌های تکثیر ایزوترمال خانواده‌ای از روش‌ها هستند که بر خلاف PCR به چرخه‌های حرارتی نیاز ندارند، بلکه در دمای ثابت عمل تکثیر DNA را انجام می‌دهند. از برجسته‌ترین این روش‌ها Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) و Recombinase Polymerase Amplification (RPA) هستند. در روش LAMP از آنزیم Bst DNA پلیمراز و مجموعه‌ای از ۴ تا ۶ پرایمر اختصاصی استفاده می‌شود که روی چند ناحیه متفاوت از ژنوم هدف طراحی شده‌اند؛ این پرایمرها ساختاری حلقه‌ای ایجاد کرده و تکثیر تصاعدی DNA را در دمای حدود ۶۰–۶۵ درجه انجام می‌دهند. خروجی واکنش LAMP حجم انبوهی از DNA دو‌رشته‌ای است که می‌تواند از طریق تغییر کدری محلول، رنگ‌آمیزی معرف‌های فلورسانس یا روش‌های دیگر به سرعت شناسایی شود. برای HPV پرخطر گزارش شده که LAMP طی حدود ۳۰–۴۵ دقیقه می‌تواند نتیجه را مشخص کند.

یکی از کاربردهای جالب LAMP، ترکیب آن با نوارهای جریان جانبی (Lateral Flow Assay) است. در این رویکرد، محصولات آمپلیفیکاسیون (که معمولاً برچسب بیوتین دارند) روی کاست‌های کاغذی جریان یافته و توسط نانوذرات طلا یا کونژوگه‌های آنتی‌بادی رنگی آشکار می‌شوند. چنین تست‌هایی شبیه به تست بارداری خانگی عمل می‌کنند و نیاز به تجهیزات پیچیده ندارند. یک مطالعه نشان داد که تست ترکیبی LAMP-LFA برای HPV16 و HPV18 قادر است با حد تشخیص حدود 10 نسخه در میکرولیتر طی کمتر از ۴۵ دقیقه نتیجه مثبت را به شکل یک نوار رنگی آشکار کند. مزیت عمده LAMP و RPA این است که سریع، ارزان و قابل حمل بوده و تنها به یک منبع گرمای ثابت (مانند بلوک حرارتی ساده یا حتی گرم‌کن شیمیایی) نیاز دارند. این ویژگی‌ها، آن‌ها را برای نقاط مراقبتی (POCT) یا کاربرد در مناطق کم‌دسترسی به آزمایشگاه ایده‌آل می‌کند.

با این حال، دقت و صحت این روش‌ها معمولاً کمی پایین‌تر از PCR استاندارد گزارش شده است. برای مثال، پژوهش‌ها حاکی از آن است که حساسیت و ویژگی LAMP در تشخیص HPV اندکی کمتر از Real-Time PCR است و امکان آلودگی یا نتایج مثبت کاذب به دلیل تکثیر غیراختصاصی وجود دارد. در مطالعه‌ای اشاره شده که سنجش LAMP-LFA گرچه سریع‌تر و بی‌نیاز از دستگاه پیشرفته است، اما نسبت به PCR استاندارد مختصری حساسیت پایین‌تری دارد و همچنین مستعد آلودگی است. به علاوه، در LAMP طراحی مناسب شش پرایمر برای هر ژنوتیپ HPV پیچیده است و معمولاً هر بار فقط یک نوع ویروس را می‌توان هدف قرار داد.. RPA نیز به علت نیاز به آنزیم‌های گران‌قیمت و گاهی مشکلات اتصال غیراختصاصی، هنوز به طور وسیع برای HPV به کار نرفته است. در مجموع، تکنیک‌های هم‌دما آینده امیدوارکننده‌ای در تشخیص سریع HPV دارند.

روش‌ CRISPR

سامانه‌های CRISPR-Cas که به خاطر کاربرد در ویرایش ژن مشهور شده‌اند، اخیراً به عرصه تشخیص مولکولی نیز وارد شده‌اند. در این روش، از آنزیم‌های Cas (مثل Cas12a یا Cas13) که با راهنماهای RNA می‌توانند توالی خاصی از اسید نوکلئیک را شناسایی و برش دهند، برای شناسایی حضور DNA یا RNA ویروس استفاده می‌شود. مزیت کلیدی کریسپر این است که به صورت بسیار اختصاصی توالی هدف را شناسایی می کند. به محض شناسایی حتی چند نسخه از توالی اختصاصی (مثلاً قطعه‌ای از ژن E6/E7 HPV16) توسط کمپلکس Cas-guideRNA، آنزیم فعال شده و شروع به شکستن مولکول‌های گزارشگر می‌کند. این شکستن سیگنال فلورسنت تولید می‌نمایند. برای افزایش حساسیت، معمولاً مرحله تقویت مقدماتی مانند RPA یا PCR انجام می‌شود و سپس محصول در معرض سیستم کریسپر قرار می‌گیرد. دلیل این امر این است که CAS می بایست چند سلول هدف را ببیند.

مزیت روش‌های کریسپر این است که می‌توانند در فرمت ساده و بدون نیاز به تجهیزات پیچیده اجرا شوند. به عنوان مثال، سیستم‌هایی طراحی شده که واکنش کریسپر را روی تراشه‌های میکروفلوئیدیک یا نوارهای کاغذی انجام می‌دهند و نتیجه به کمک یک گوشی هوشمند یا به چشم قابل مشاهده است. همچنین کریسپر اجازه Multiplexing پیشرفته را می‌دهد. چندین راهنمای RNA مختلف همراه با آنزیم‌های متمایز یا برچسب‌های گوناگون می‌توانند حضور چند ژنوتیپ HPV را به طور همزمان گزارش کنند.

البته لازم به ذکر است که بیشتر فناوری‌های کریسپر-محور هنوز در مرحله تحقیقاتی هستند و چالش‌هایی مانند جلوگیری از آلودگی، پایدارسازی آنزیم‌ها در دمای محیط، و صحت سنجی بالینی در مقیاس وسیع باقی مانده است. همچنین این روش‌ها معمولاً به تقویت اولیه نیاز دارند که خود مرحله‌ای اضافی است (مثلاً RPA)، هرچند تلاش‌هایی برای ترکیب مستقیم کریسپر با مراحل تقویتی در یک سیستم یکپارچه در حال انجام است. به طور خلاصه، تشخیص مبتنی بر CRISPR یک حوزه نوظهور و بسیار جذاب در آزمون‌های HPV است که می‌تواند در آینده دقت و سهولت تشخیص را بیش از پیش ارتقا دهد، اما در حال حاضر به عنوان مکملی در پژوهش‌ها به کار می‌رود و هنوز جایگزین روش‌های مرسوم نشده است.

آزمون‌های HPV بر پایه RNA ویروسی (تشخیص mRNA)

یک روش دیگر تشخیص، سنجش RNAهای پیام‌رسان (mRNA) ویروس HPV است. ایده اصلی در اینجا تمرکز بر ژن‌های بیان‌شده ویروس مانند E6 و E7 است که در ایجاد تغییرات سرطانی نقش دارند. روش آزمون HPV E6/E7 mRNA روش معروفی است که در این روش به جای DNA، وجود RNAهای E6/E7 ویروس در سلول‌های دهانه رحم با تکنیک‌های تقویت اسید نوکلئیک (اغلب تکثیر با واسطه رونویسی TMA یا Real-Time RT-PCR) بررسی می‌شود.

مزیت کلیدی سنجش mRNA این است که فعالیت ویروس را نشان می‌دهد. حضور DNA ویروس الزاماً به معنای عفونت فعال و در حال پیشرفت نیست، زیرا ممکن است ویروس به صورت نهفته وجود داشته باشد یا سیستم ایمنی آن را مهار کرده ولی بقایای ژنومی باقی مانده باشد. در مقابل، تشخیص mRNAهای E6/E7 بیانگر آن است که ویروس در حال تولید پروتئین‌های سرطان‌زا است و لذا احتمال پیشرفت ضایعه بالاتر است. به همین دلیل، تست‌های mRNA از نظر اختصاصیت بالینی بهتر عمل می‌کنند و موارد مثبت کاذب کمتری دارند. برای مثال، یک مطالعه مقایسه‌ای نشان داد که آزمون E6/E7 mRNA برای شناسایی ضایعات HSIL و سرطان دهانه رحم اختصاصیتی حدود ۸۹٪ و ارزش پیش‌بینی مثبت ۹۴٪ دارد، در حالی که تست HPV-DNA در همان جمعیت اختصاصیت ۵۵٪ و PPV حدود ۸۴٪ نشان داد. این بدان معناست که نتیجه مثبت تست mRNA با احتمال بیشتری واقعاً نشان‌دهنده وجود ضایعه پیش‌سرطانی جدی است و کمتر پیش می‌آید که یک عفونت گذرا را بزرگنمایی کند.

البته نقطه مقابل این مزیت، کاهش اندکی در حساسیت است. آزمون‌های DNA هر گونه وجود ویروس را حتی در سطوح پایین شناسایی می‌کنند، در حالی که آزمون mRNA ممکن است در عفونت‌هایی که بیان ژن فعال آغاز نشده یا بسیار کم است، منفی باشد. در واقع مطالعات مختلف گزارش کرده‌اند که تست‌های mRNA اندکی موارد پرخطر بیشتری را نسبت به DNA از دست می‌دهند (حساسیت کمتر)، اما در عوض هر مورد مثبتی که می‌دهند از اهمیت کلینیکی بیشتری برخوردار است. بنابراین یک رویکرد تلفیقی نیز مطرح شده که ابتدا از تست DNA به عنوان غربالگری حساس استفاده شود و برای موارد مثبت مرزی یا مشکوک، تست mRNA به عنوان تریاژ جهت تعیین نیاز به کولپوسکوپی انجام گیرد. در مجموع، آزمون‌های HPV مبتنی بر mRNA یک روش نوین و مکمل در تشخیص افتراقی عفونت‌های HPV هستند که می‌توانند به کاهش اقدامات تشخیصی غیرضروری (مانند بیوپسی در مواردی که عفونت فعال نیست) کمک کنند. با این حال، این روش‌ها نیز نیازمند آزمایشگاه مجهز (برای انجام TMA یا RT-PCR) بوده و از نظر اجرا شبیه سایر تست‌های مولکولی هستند.

جمع بندی

با جمع‌بندی مطالب می‌توان گفت فناوری تشخیص HPV مسیری را از روش‌های سنتی کم‌حساس (مثل پاپ‌اسمیر) به‌سوی روش‌های مولکولی دقیق‌تر پیموده است. اکنون Real-Time PCR به عنوان یک روش استاندارد جهانی، ترکیبی از حساسیت و اختصاصی بودن را ارائه می‌دهد که باعث شناسایی به‌ موقع عفونت‌های پرخطر HPV می شود . روش‌های نوین هر به نوبه خود کاستی های روشهای سنتی را برطرف نموده اند. روش‌های mRNA دقت تشخیصی را در زمینه بالینی بهبود می‌بخشند. هرچند ممکن است هنوز هیچ‌یک به تنهایی کامل نباشد، اما ترکیب هوشمندانه این ابزارها می‌تواند استراتژی غربالگری و تشخیص را کاراتر کند.

از دیدگاه تجاری و کاربردی، بهره‌گیری از جدیدترین تکنولوژی‌های تشخیصی مزایای زیادی برای آزمایشگاه‌ها و مراکز درمانی دارد. استفاده از تست‌های مولکولی پیشرفته مانند Real-Time PCR یا کیت‌های نوین با روشهای تکثیر هم‌دما، می‌تواند سرعت و دقت تشخیص را افزایش داده و رضایت بیماران و پزشکان را جلب کند. همچنین اتوماسیون و سهولت کاربری در نسل جدید دستگاه‌ها و کیت‌ها به این معناست که آزمایشگاه‌ها با سرمایه‌گذاری در این فناوری‌ها می‌توانند حجم نمونه بیشتری را در زمان کمتر پردازش کرده و از نظر اقتصادی نیز بهره‌وری خود را بالا ببرند. برای مثال، دستگاه‌های Real-Time PCR تمام‌اتوماتیک امروزی، فرآیند را از استخراج تا نتیجه نهایی بدون دخالت دست انجام می‌دهند و نیاز به نیروی انسانی متخصص را کاهش می‌دهند.

در نهایت، تشخیص دقیق و زودهنگام HPV پرخطر کلید پیشگیری از سرطان دهانه رحم است. هر روش تشخیصی که بتواند این هدف را بهتر تامین کند، در خدمت سلامت جامعه خواهد بود. مطالعات نشان داده‌اند تغییر رویکرد از روش‌های سنتی به آزمایش HPV منجر به کشف زودتر ضایعات و کاهش موارد پیشرفته سرطان شده است. از این رو، سرمایه‌گذاری بر روی تکنیک‌های نوین مانند Real-Time PCR و فراتر از آن (ایزوترمال، کریسپر و …) برای هر مجموعه‌ای که در زمینه تشخیص بیماری‌های عفونی و به‌خصوص سلامت زنان فعالیت دارد، یک مزیت استراتژیک به حساب می‌آید. چنین مجموعه‌ای می‌تواند با ارائه سریع‌ترین و دقیق‌ترین خدمات، اعتماد پزشکان و بیماران را به خود جلب کرده و سهم بازار خود را گسترش دهد. با توجه به رقابتی بودن حوزه تجهیزات و کیت‌های تشخیصی، همراهی با دانش روز و بهره‌گیری از روش‌های نوین قطعا گامی هوشمندانه در جهت موفقیت تجاری و علمی خواهد بود.

منابع:

1. Bartošík M, et al. J Med Virol. 2024 – Advanced technologies towards improved HPV diagnosticspubmed.ncbi.nlm.nih.govpubmed.ncbi.nlm.nih.gov
2. Micalessi I, et al. Front Cell Infect Microbiol. 2024 – Portable, ultrasensitive HPV tests (PCR vs improved PCR)frontiersin.orgfrontiersin.org
3. Schmitt M, et al. J Clin Microbiol. 2013 – qPCR reduces false-positives vs conventional PCRfrontiersin.org
4. Zhang L, et al. J Med Virol. 2018 – High-risk HPV genotyping real-time PCR vs PCR-RDB performancepubmed.ncbi.nlm.nih.govpubmed.ncbi.nlm.nih.gov
5. Saiki Y, et al. J Mol Pathol. 2020 – Pap test sensitivity vs HPV DNA test; HPV DNA >90% sensitivity for CIN2+mdpi.commdpi.com
6. Nature Reviews Cancer. 2007 – Canadian trial: HPV testing 94.6% sensitive vs Pap 55.4%nature.comnature.com
7. BMC Cancer. 2010 – PCR higher analytical sensitivity than HC2; PCR detected latent HPVbmccancer.biomedcentral.combmccancer.biomedcentral.com
8. Landaverde L, et al. 2020 – LAMP-LFA for HPV16/18 in <45 min (LOD ~10 copies/µL), slightly lower accuracy vs PCRfrontiersin.org
9. Dabeski D, et al. 2019 – HPV E6/E7 mRNA test higher specificity (88.9%) vs DNA test (55.6%) for HSIL+ lesionspubmed.ncbi.nlm.nih.gov